整合素β₃和细胞内粘附分子在子宫内膜异位症在位与异位内膜组织中的表达

伍俊萍　张俊慧　刘银坤　张惜阴

　　【摘要】　目的　探讨整合素β₃和细胞内粘附分子（ICAM）与子宫内膜异位症的关系。方法　收集子宫内膜异位症患者的子宫内膜（15例）、异位病灶组织（15例）及非子宫内膜异位症患者（30例，对照组）的子宫内膜，分3批对这些组织进行整合素β₃和ICAM的蛋白免疫印记法测定，并用VDS扫描对实验结果进行半定量。每批结果均用方差分析和t检验进行统计处理。结果　3批结果趋势相同，子宫内膜异位症患者子宫内膜的整合素β₃和ICAM蛋白表达量均明显低于对照组同期子宫内膜的表达量。而异位病灶组织整合素β₃的表达较对照组明显降低，ICAM表达却明显高于对照组。结论　子宫内膜异位症患者从子宫内膜到异位病灶，整合素β₃和ICAM均有明显的变化，这可能与子宫内膜异位症发生、发展和不孕有关。
　　【关键词】　子宫内膜异位症　　细胞粘着分子　　抗原，CD　　血小板膜糖蛋白类

Expression of Integrin β₃ and Intracellular Adhesion Molecule in Endometrium and Endometriotic Tissue
WU Junping^*, ZHANG Junhui^*, LIU Yinkun, et al.
^* Obstetrics and Gynecology Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai 200011

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between integrin β₃ ,intracellular adhesion molecule(ICAM) and endometriosis. Methods　The expression of integrin β₃ and ICAM protein were determined in 3 batches by immunoblotting method in 15 endometrium and 15 endometriotic tissues of patients with endometriosis and 30 endometrium from non-endometriosis subjects during the same menstrual phase. The results were scanned and semi-quantified, and then analysed by F test and t test. Results　The results from 3 measurements showed the same trend .Endometrium from patients with endometriosis expressed significantly fewer integrin β₃ and ICAM protein than those without endometriosis. On the other hand , the expression of integrin β₃ in endometriotic tissue was significantly lower while the ICAM expression was significantly higher than those in controls.Conclusions　In patients with endometriosis, integrin β₃ and ICAM expression changed significantly from eutopic to ectopic endometrium which may be related to the development of endometriosis and infertility.
　　【Key words】　Endometriosis　　Cell adhesion molecules　　Antigens, CD　　Platelet membance glycoproteins

　　子宫内膜异位症（内异症）虽是良性疾病，但其广泛种植、易复发的特性与恶性肿瘤十分相似。整合素β₃和细胞内粘附分子(ICAM)与恶性肿瘤关系密切，在肿瘤转移、种植等行为上有一定作用。本研究测定整合素β₃和ICAM在子宫内膜与异位组织中的表达，探讨这些粘附分子与内异症的关系。

资料与方法
　　一、资料来源
　　1．研究组：1997年6月至12月就诊于上海医科大学妇产科医院，因内异症行全子宫切除或(和)卵巢子宫内膜异位囊肿切除或(和)异位病灶切除术的患者25例，年龄25～45岁，无其他内、外科疾病。子宫切除后立即刮取子宫内膜，标本置-20℃保存，子宫内膜组织标本15份，异位病灶(病理检查证实)组织标本15份。
　　2．对照组：30例，为上海医科大学妇产科医院1997年6月至12月的门诊或住院患者，年龄25～45岁，无其他内、外科疾病，其中10例为因月经失调行诊断性刮宫术，20例为子宫肌瘤行全子宫切除术，术后即取子宫内膜，置-20℃保存，病理检查显示增生期、分泌期内膜各为15份。
　　二、方法
　　1．标本处理：取组织约0.1～0.3 g剪碎，加入RIPA裂解液（0.5%去氧胆酸钠,0.1％ SDS，1% NP-40，1/1 000苯甲基磺酰氟）500 μl，振摇后冰浴30分钟。然后4℃、5 000 r/min离心15分钟，弃沉淀物。上清液中含有待测可溶性整合素β₃和ICAM，-20℃保存待测。
　　2．蛋白定量：取上清液20 μl用蒸馏水稀释至1 ml，用美国Pharmacia公司出品的UV3000分光光度仪测量260 nm和280 nm处的吸光度，得出蛋白浓度，再换算成原液中的浓度。
　　3．免疫印迹法：将PVDF膜放入甲醇中浸泡3分钟，蒸馏水漂洗，放入点杂交仪中，装好负压水泵，负压形成后用0.02 mol磷酸缓冲液（PBS）10 μl点膜，然后用标本原液5 μl点膜（3份），点样完毕后，将膜浸入封闭液（15 mmol Tris-HCl、pH7.4, 0.15 mol NaCl,0.25%明胶，3％ BSA），室温下置摇床上振荡1小时，然后置于含抗单克隆抗体（1∶1 000）（整合素β₃抗体是日本Tharming gen 公司出品，货号为2441D的纯抗鼠整合素β₃；ICAM抗体是美国Santa Cruz Biotechnology公司出品，货号为107lotaF307的小鼠单克隆抗体IgG）的封闭液中，4℃过夜。次日用洗涤液1（0.02 mol PBS、pH7.4, 0.5% Tween 20）洗10分钟、3次，洗涤液2（0.05 mol Tris-HCl、 pH7.5, 0.15 mol NaCl）洗10分钟，置于含标记辣根过氧化物酶的羊抗鼠IgG（1∶1 000）的封闭液中，室温下1小时，再用洗涤液2洗10分钟、3次，用二氨基联苯胺作为底物显色，PBS终止。膜晾干后扫描拍照。
　　4．VDS扫描定量：将免疫印迹法显色好的PVDF膜晾干，即在VDS扫描系统(美国Pharmacia公司产品)上扫描，得到每点的面积扫描定量（mass）值，并换算成单位蛋白浓度(U，mg/L)的mass值。整合素β₃和ICAM目前尚无国际公认的单位，本研究中的单位是为便于半定量比较而设定。
　　三、统计学方法
　　结果以±s表示，采用方差分析和t检验。本研究所用免疫印记法是用96孔点杂交仪，每批实验仅能加32份样品，因目前无整合素β₃和ICAM的定量标准品，批间误差较难控制，故仅对同批的实验结果进行统计学分析。

结　果
　　将研究组和对照组标本分3批实验，每批均包括各组标本。3批实验结果趋势相同，取其中1次：7例内异症患者子宫内膜组织7份，9例内异症患者异位内膜组织9份，对照组14例的子宫内膜组织共14份，增生及分泌期子宫内膜各7份。
　　一、蛋白定量结果
　　对照组增生期子宫内膜蛋白浓度平均为（33.1±3.7）mg/L，分泌期子宫内膜蛋白浓度平均为（34.2±5.6）mg/L，研究组子宫内膜蛋白浓度平均为（31.6±4.9）mg/L，异位内膜蛋白浓度平均为（31.7±3.6）mg/L，各组间差异无显著性（P>0.05）。
　　二、免疫印迹法半定量结果
　　1．对照组子宫内膜整合素β₃和ICAM蛋白的表达：对照组增生期子宫内膜整合素β₃蛋白平均表达（0.45±0.01）mass值/U，分泌期子宫内膜整合素β₃蛋白平均表达（0.39±0.06）mass值/U，两组差异无显著性（P>0.05）；对照组增生期子宫内膜ICAM蛋白表达量平均为（0.70±0.20）mass值/U，分泌期子宫内膜ICAM蛋白表达量平均为（0.86±0.34）mass值/U，两者之间差异亦无显著性（P>0.05）。
　　2．内异症子宫内膜整合素β₃和ICAM蛋白的表达：内异症子宫内膜均为分泌期子宫内膜，故与对照组分泌期子宫内膜比较。内异症子宫内膜整合素β₃的表达量为（0.33±0.03） mass值/U，与对照组的表达量相比，差异无显著性（P＝0.05）。内异症患者子宫内膜ICAM蛋白的表达量平均为（0.58±0.17）mass值/U,与对照组相比，差异有显著性（P<0.05）。
　　3．内异症异位内膜整合素β₃和ICAM蛋白的表达：因异位内膜在病理诊断上均处于增生期，故将异位内膜的检测结果与对照组增生期子宫内膜检测结果比较。异位内膜表达整合素β₃蛋白量为（0.32±0.06）mass值/U，对照组为（0.45±0.10）mass值/U，两者比较，差异有极显著性（P<0.01）；异位内膜ICAM蛋白表达量为（1.16±0.38）mass值/U，对照组为（0.70±0.20）mass值/U，两者比较，差异有显著性（P<0.05）。

讨　论
　　一、整合素β₃和ICAM的功能
　　整合素β₃和ICAM是两种粘附分子，前者是细胞外基质纤维连接蛋白等的受体，与细胞分化、维持细胞形态、细胞间联系有密切关系。ICAM是粘附分子免疫球蛋白家族中的一种，主要存在于白细胞表面，子宫内膜间质细胞也有较多的ICAM^［1］。它对介导细胞-细胞粘附有重要作用。一些细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、γ干扰素等，可刺激其活性，而糖皮质激素可抑制其活性，以影响T细胞介导的免疫反应^［2］。这两种粘附分子在肿瘤细胞的生长、转移上已有较多的研究，在内异症方面的研究却较少。而内异症发生学上的种植学说与肿瘤细胞的播散很相似^［3］，整合素β₃和ICAM在其中也会有变化。
　　二、整合素β₃和ICAM在内异症子宫内膜组织中的表达
　　本研究以非内异症的良性妇科疾病患者做为对照组，发现增生期和分泌期子宫内膜表达的整合素β₃和ICAM蛋白无明显差异。多数学者认为，正常子宫内膜分泌期表达的整合素β₃较增生期高或仅有分泌期表达^［4，5］。本研究与此有差异，可能是由于病例选择及实验方法不同所致。已报道的文献基本采用免疫组织化学的方法，从标本量到判断标准均不一致，而即使同样的方法也有相反的结果^［6，7］。ICAM蛋白在子宫内膜不同时期的表达尚未见报道。所以，这两种粘附分子在正常子宫内膜不同时期的表达，还需更多的研究验证。
　　本研究结果发现，内异症分泌期子宫内膜表达的整合素β₃蛋白低于对照组。这与文献报道的结果一致^［5］。同样，内异症分泌期子宫内膜ICAM的表达量也明显低于对照组同期子宫内膜。这说明，内异症患者的子宫内膜已经发生变化，而且由于整合素β₃蛋白在维持细胞形态、分化等方面有重要作用，所以这两种粘附分子的蛋白表达下降可能意味着子宫内膜的稳定性、与基底膜的粘着性降低，因而容易“异位”。另一方面，整合素β₃在分泌期的异常表达使子宫内膜对胚胎的容受性发生改变以致不孕。这与分泌期孕激素受体降调节规律有关，可能是内异症患者不孕的原因之一^［4］。
　　三、整合素β₃以及ICAM在异位内膜组织中的表达
　　本研究还测定了异位内膜中整合素β₃蛋白和ICAM蛋白的表达量。由于病理上异位内膜均为增生期变化，所以将结果与对照组增生期子宫内膜的表达量比较，整合素β₃明显低于对照组（P<0.01），异位内膜ICAM蛋白表达量明显高于对照组（P<0.05）。这显示，子宫内膜异位病灶的粘附分子的变化更为多样。特别是ICAM的表达升高，可产生免疫抑制和降低自然杀伤细胞的杀细胞毒性，这有助于异位组织逃避机体免疫系统和自然杀伤细胞的杀伤，对异位组织侵入腹膜、卵巢等起促进作用^［8］。

作者单位：伍俊萍，张俊慧，张惜阴（200011上海医科大学妇产科医院）
　　　　　刘银坤（上海医科大学中山医院肝癌研究所）

参考文献
　1　Somigliana E, Vigano P, Gaffuri B, et al. Human endometrial stromal cells as a source of soluble intercellular adhesion molecule(ICAM)-1 . Hum Reprod， 1995,11:1190-1194.
　2　Stolpe A, Saag PT. Intercellular adhesion molecle-1. J Mol Med, 1996,74:13-33.
　3　Lessey BA, Young SL. Integrins and other cell adhesion molecules in endometrium and endometriosis. Sem Reprod Endocrinol， 1997, 15: 291-299.
　4　Lessey BA, Yeh I, Castelbaum AJ, et al. Endometrial Progesterone receptors and markers of uterine receptivity in the window of implantation. Fertil Steril， 1996, 65:477-483.
　5　Rai V, Hopkicson J, Kennedy S, et al. Integrins alpha 3 and alpha 6 are differentially expressed in endometrium and endometriosis. J Pathol，1996, 180:181-187.
　6　Bridges JE, Prentice A, Roche W, et al. Expression of integrin adhesion molecules in endometrium and endometriosis. Br J Gynecol， 1994, 101:696-700.
　7　Martins S, Thomas R, Sophia P, et al. Endometrial integrin expression is independent of estrogen or progestin treatment in vitro. Fertil Steril， 1997, 67:877-882.
　8　Vigano P, Pardi R, Magri B, et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) on cultured human endometrial stromal cells and its role in the action with nature killers. Am J Reprod Immunol， 1994, 32:139-145.