朱梅　刘再萍　张鑫　邱明才

　　【摘要】　目的　了解卵巢切除(OVX)大鼠胫骨对雌激素治疗的反应。方法　将33只雌性大鼠随机分成3组,每组11只:OVX组、对照组和治疗组。对OVX组与治疗组大鼠行OVX手术，建立骨质疏松动物模型,治疗组于OVX术后1个月予尼尔雌醇喂养，药物喂养3个月后处死,用骨形态计量学方法检测OVX大鼠左后肢胫骨干骺端对尼尔雌醇治疗的反应。结果　OVX组大鼠骨小梁体积、平均骨小梁宽度、平均骨小梁密度和皮质骨平均厚度(骨骺部分)，均较对照组显著减少(P<0.05)；四环素标记表面、类骨质表面和组织水平的骨形成速率等，均较对照组显著增加(P<0.05)；矿化沉积速率、类骨质成熟时间和矿化延迟时间，较对照组缩短(P<0.05)。尼尔雌醇治疗3个月可显著增加OVX大鼠干骺端骨量(P<0.05),但仍显著低于对照组(P<0.05)；四环素标记表面、类骨质表面和组织水平的骨形成速率均显著低于OVX组(P<0.05)。结论　尼尔雌醇能降低骨转换,增加骨量。
　　【关键词】　骨质疏松，绝经后　　阉割　　炔雌醚　　骨密度

Study of Nylestriol Effect on Bone Histomorphometric Parameters in Ovariectomized Rats 　ZHU Mei, LIU Zaiping, ZHANG Xin, et al. General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052
　　【Abstract】　Objective　To investigate the response of trabecular bone of ovariectomized (OVX) rats to nylestriol. Methods　Thirty-three female Wistar rats were randomly divided into three groups,11 rats in each: nylestriol-treated group (E),OVX and the control (C).The OVX rats were used as a model for osteoporosis.After being fed with nylestriol for 3 months,all rats were sacrificed.The effect of nylestriol on bone microarchitecture and dynamics were studied by bone histomorphometry. Results　The data suggest that trabecular bone volume,mean trabecular width ,density and cortical thickness were remarkably reduced in OVX group (P<0.05) while tetracycline labeled surface, osteoid surface and bone turnover rate were increased in comparison with that in C group (P<0.05).The bone turnover rate and trabecular bone volume were improved with the treatment of nylestriol for 3 months in the OVX rats(P<0.05). Conclusions　Trabecular bone volume and bone turnover rate can be improved by 3 month administrations of nylestriol in osteoporotic rat models.
　　【Key words】　Osteoporosis, postmenopausal 　　Castration　　Quinestro　　Bone density

　　绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis, PMO)是中老年妇女的常见病和多发病,与内分泌、体育锻炼、遗传和营养等多种因素有关。绝经后卵巢功能衰竭所致的雌激素缺乏在PMO发生过程中起着重要作用^［1］。绝经后骨丢失所造成的病理性骨折，严重地影响着中老年妇女的身体健康,甚至威胁生命。因此,雌激素替代治疗(ERT)作为预防和治疗PMO的首选方法正在被逐渐接受。近年的研究结果表明,雌激素可抑制骨吸收而减少骨丢失，但对雌激素是否刺激骨形成尚有争议。为探讨雌激素对骨组织作用的机理,我们进行了下述实验研究。

　　一、实验动物
　　33只雌性Wistar大鼠(天津医科大学实验动物中心提供),平均月龄1.5月(1～2月),随机分为3组,每组11只,组间大鼠体重无统计学差异。饲养1个月后,随机选取2组动物实行双侧卵巢切除术(OVX),并将其分为治疗组和OVX组,其余一组大鼠未施任何手术，为对照组。术后1个月治疗组予尼尔雌醇进行药物治疗。给予药物治疗3个月,共5个月后处死。喂养及药物治疗方法:对照组与OVX组,普通固体饲料（天津医科大学实验动物中心提供）和去离子水喂养，治疗组普通固体饲料和去离子水喂养，尼尔雌醇(1 mg/片，北京四环制药厂生产)以0.1 mg/100 g体重灌胃,每2周1次,共3个月。
　　二、骨标本的制备
　　1.四环素双标记:在处死动物前15天进行第1次标记，方法：四环素每天30 mg/kg,分2次灌胃,连续2天；9天后进行第2次标记,方法同前。在第2次标记后3天即喂养5个月后，经股动脉放血处死动物,取左后肢胫骨备用。
　　2.不脱钙骨磨片的制备:将留取的左后肢胫骨标本用砂纸磨成2～3mm厚骨髓腔暴露的骨片,置于0.5%的Villanueva染色剂中染色72小时。随后在磁力搅拌器搅拌下,依次用70%、95%和100%的乙醇和丙酮将骨标本脱水脱脂,再将标本置于塑料包埋盒中,用聚甲基丙烯酸甲酯包埋,置于真空干燥箱中干燥,待包埋块变硬后取出。用钢锯将包埋块锯成约300 μm厚的薄骨片，用水砂纸将骨标本磨制成100μm厚的不脱钙骨磨片,封片备用。
　　三、骨计量学参数的测量和计算
　　1.骨组织形态计量学参数:(1)全部骨组织体积［total tissue volume,TTV(mm³)］:包括骨皮质体积和海绵骨体积；(2)海绵骨体积［sponge bone volume, SBV(mm³)］:骨髓腔和骨小梁体积之和；(3)骨小梁体积［trabecular bone volume,TBV(mm³)］:包括骨小梁矿化和未矿化的类骨质体积之和；(4)骨小梁表面［trabecular bone surface,TBS(mm²)］:所测范围内的骨小梁表面积；(5)骨小梁表面和体积之比［S/V(mm²/mm³)］:即TBS和TBV的比值,表明单位骨小梁体积占所有骨表面的多少；(6)平均骨皮质宽度［MCW(μm)］:所测范围内骨皮质宽度的平均值；(7)骨小梁宽度［trabecular width,TbW(μm）］:测量吸收陷窝附近的同一骨小梁宽度，用以表示吸收前该处骨小梁的宽度；(8)平均骨小梁板厚度［mean trabecular plate thickness,MTPT(μm)］:MTPT=TBV/TBS×2 000^［2］；(9)平均骨小梁板密度［mean trabecular plate density,MTPD(/mm²)］:每mm²骨小梁的数量,即:MTPD=(TBV/TBS)×(10/MTPT);(10)平均骨小梁板间隙［mean trabecular plate spacing,MTPS(μm)］:骨小梁板间的距离，即:MTPS=1000/MTPD-MTPT。
　　2.骨动力学参数:(1)骨小梁类骨质表面［trabecular osteoid surface,TOS(%)］:骨小梁表面类骨质占全部骨小梁表面的百分比；(2)平均类骨质宽度［mean osteoid seam width,MOSW(μm)］:类骨质靠近骨髓腔表面到类骨质与矿化骨交界处的平均距离；(3)四环素单标记表面占骨小梁表面的百分比［Sfract(s)(%)］:沿骨表面走行的标记线长度占全部骨表面长度的百分比；(4)四环素双标记表面占骨小梁表面的百分比［Sfract(d)(%)］:两次标记的四环素沉积于骨表面所形成的双标记线长度占骨小梁表面长度的百分比；(5)四环素双标记和单标记表面之和占骨小梁表面的百分比［Sfract(d+s)(%)］；(6)四环素双标记线间的平均距离［distance of double label,DDL(μm)］:内标记带内缘到外标记带内缘之间的平均距离,表明两次给药期间形成的矿化骨厚度；(7)矿化沉积速率［mineral appositional rate,MiAR(μm/d)］:两条标记带间的平均距离除以两次给药间隔的天数,即每天矿化类骨质的多少,即:MiAR=（DDL×π/4）/11；(8)矿化延迟时间［mineeralization lag time,MLT(d)］:是类骨质厚度与矿化沉积速率的比值，即：MLT=MOSW/MiAR，成骨细胞合成类骨质覆盖骨小梁表面,随后发生矿物盐沉积，表明从类骨质合成到矿化开始中间相隔的时间；(9)组织水平的骨形成速率［Svf（μm³/μm²/d)］:单位面积骨小梁表面每天新生成矿化骨的多少,即:Svf=MiAR×Sfract(d+1/2s)；(10)类骨质成熟时间［osteoid maturation period,OMP(d)］:含义与MLT基本相同,但计算方法不同,反映水平不同，OMP反映细胞水平,而MLT反映组织水平,即:OMP=MOSW/Svf。
　　3.测量：将制备好的磨片置于普通光镜和荧光显微镜下，用Opton Contron半自动图象分析仪测量骨形态学和动力学参数。
　　四、统计学方法
　　将所得数据用微机SYSTAT统计处理程序分别进行t检验和方差分析。所有参数均以±s表示。

　　荧光显微镜下,骨小梁呈浅绿色；荧光标记呈黄色；类骨质呈紫红色。各组大鼠胫骨骨形态学参数比较的结果显示，OVX组TBV/TTV、TBV/SBV、TBW和MTPD显著低于对照组(P<0.05)，亦显著低于治疗组(P<0.05)，治疗组亦显著低于对照组(P<0.05)，而OVX组MTPS显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,正常大鼠行双侧卵巢切除后,骨量明显减少、骨小梁密度减低和平均骨小梁间隙增宽；尼尔雌醇能明显增加骨量,但增加后的骨量仍显著低于对照组。尼尔雌醇还能明显增加平均骨小梁宽度(表1)。动力学参数的研究结果表明，OVX组的Sfract(d＋1/2s)、Svf和TOS/TBS显著高于对照组(P<0.05)和治疗组(P<0.05)；OVX组和治疗组的DDL、OMP和MiAR显著低于对照组(P<0.05)；OVX组MLT显著低于对照组(P<0.05,表2)。

　1　Cann CE, Martin MC,Genant HK,et al. Decreased spinal mineral content in amenorrheic women.JAMA,1984,251:626-629.
　2　Parfitt AM,Mathews CHE,Villanueva AR,et al. Relationship between surface,volume and thickness of iliac trabecular bone in aging and in osteoporosis.J Clin Invest,1983,72:1396-1409.
　3　Wronski TJ,Yen CF.The ovariectomized rat as an animal model for postmenopausal bone loss. In :Webster SS,ed. The aged rat model for bone biology studies. Chicago: Scanning Microscopy Internation，1991. 10-20
　4　Kalu DN. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone Miner,1991,15:175-192.
　5　程国钧,刘建立，叶惠方，等.尼尔雌醇防治绝经后妇女血脂紊乱的前瞻性研究.中华妇产科杂志，1991，26:349-351.
　6　陆湘云,颜本元.尼尔雌醇治疗更年期综合征339例.新药和临床,1989,8: 183-186.
　7　刘建立,樊薇，程国钧，等.尼尔雌醇对绝经后子宫内膜的影响.中华妇产科杂志,1993,28:76-78.
　8　Takano YT,Rodan GA.Direct effects of 17β-estradiol on trabecular bone in ovariectomized rats.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:2172-2176.
　9　Chow J,Tobias JH,Colston KW,et al. Estrogen maintains trabecular bone volume in rats not only by suppression of bone resorption but also by stimulate of bone formation.J Clin Invest,1992, 89:74-78.
　10　Wronski TJ,Cintron M,Doherty AL,et al. Estrogen treatment prevents osteopenia and depresses bone turnover in ovariectomised rats. Endocrinology, 1988, 123:681-686.
　11　Marx CW.Do estrogens improve bone mineral density in osteoporotic women over age 65?J Bone Miner Res,1992，7:1275-1279.