ci_logo.gif (4000 bytes) 中华妇产科杂志
CHINESE JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
1998年10月　第33卷　第10期		 科技期刊


*论著*

母-胎免疫识别低下型反复自然流产的
供者及配偶白细胞免疫治疗

李大金　李超荆　朱影　王明雁　王文君　孙晓溪　孟毅　邵彦红

　　【摘要】　目的　比较供者及配偶白细胞免疫疗法治疗母-胎免疫识别低下型反复自然流产(RSA)的临床疗效。方法　将40例封闭抗体缺乏的RSA患者随机分成两组，分别采用供者白细胞(静脉)与配偶白细胞(皮内加静脉)行免疫治疗。封闭抗体及抗其独特型抗体分析采用单向混合淋巴反应封闭试验、单向混合淋巴细胞反应封闭抑制试验、细胞毒试验及封闭抗体的流式细胞分析。结果　经供者或配偶白细胞免疫后，封闭抗体及抗其独特型抗体呈明显升高（P<0.05, P<0.01）。再次妊娠成功率为86.2%；新生儿体重为3 300±116 g(±s),与同期正常妊娠组比较，差异无显著性(P>0.05)。对封闭抗体的动态分析显示，配偶白细胞免疫疗法优于供者白细胞免疫疗法；但再次妊娠成功率及新生儿体重在两者间差异无显著性。结论　供者或配偶白细胞免疫，能有效刺激母-胎免疫识别低下型RSA患者产生封闭抗体及抗其独特型抗体，并导致妊娠成功。白细胞免疫疗法对新生儿体重无明显影响。
　　【关键词】 　流产，习惯性 　　免疫疗法　　 抗体，封闭 　　抗体，抗独特型

Comparative Study of the Third Party and Paternal Leukocyte Immunization in Recurrent Spontaneous Abortion of Lowered Maternal-Fetal Immuno-Recognition　Li Dajin, Li Chaojing, Zhu Ying, et al. Laboratory of Reproductive Immunology, Institute of Obstetrics and Gynecology, Shanghai Medical University, Shanghai 200011
　　【Abstract】　Objective　To compare curative effect of leukocyte immunization to recurrent spontaneous aborters(RSA) with lowered maternal-fetal immuno-recognition between transfusions of the third party leukocyte-rich erythrocyte concentrates and injections of paternal leukocytes. Methods　 Forty RSA patients with lack of blocking antibodies were randomly divided into two groups. Blocking antibodies were analysed by one-way mixed lymphocyte reaction blocking test and complement-dependent cytotoxic test, anti-idiotypic antibodies to blocking antibodies by one-way mixed lymphocyte reaction blocking inhibiting test, and flow cytometry evaluation of blocking antibodies were used to investigate effect of blocking antibodies on the CD antigens of T cells. The immunization was achieved by transfusions of the third party leukocytes or injections of the paternal leukocytes for 3 times or more at an interval of 4 weeks. Results　 It was found in dynamical analyses that levels of the blocking antibodies and their anti-idiotypic antibodies increased significantly after the aborters had been immunized. The successful pregnancy rate was 86.2% following immunization, and body weight of the infants was 3 300±116 g(±s), with no significant difference to 3 279.0±113.8 g of the infants from normal pregnancy. According to dynamics of blocking antibodies and their anti-idiotypic antibodies, the paternal leukocyte immunotherapy appeared superior to the third party one, but the successful pregnancy rate and the body weight of infants were with not different between the two immunotherapy groups. Conclusion　The third party and paternal leukocyte immunization could effectively stimulate the aborters of lowered maternal-fetal immuno-recognition to produce blocking antibodies and their anti-idiotypic antibodies, leading to successful pregnancy. The immunotherapy does not apparently influence the body weight of the delivered infants.
　　【Key words】　Abortion, habitual 　　Immunotherapy　　Antibodies, blocking 　　Antibodies, anti-idiotypic

　　 反复自然流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)患者中，除少数因生殖内分泌、染色体及生殖器官解剖学异常外，多数患者病因及发病机理不详［1］。随着生殖免疫学及其技术的发展，发现 RSA 多因母、胎免疫调节异常所致［2］。根据免疫流行病学分析，RSA可进行以下免疫病因分类：母-胎免疫识别低下型、母-胎免疫识别过度型、母-胎免疫识别紊乱型［3］。其中，以封闭抗体缺乏为主要特征的母-胎免疫识别低下型是最常见的一种类型。本研究分别选用供者白细胞静脉免疫及配偶白细胞皮内加静脉免疫，对母-胎免疫识别低下型RSA患者进行免疫治疗，观察并评价两种白细胞免疫疗法后治疗封闭抗体及抗其独特型抗体的动态变化及妊娠预后。

资料及方法

　　一、研究对象
　　40例RSA患者来自1990年1月至1996年1月就诊于上海医科大学妇产科医院生殖免疫专科门诊的患者。经生殖免疫学系统分析属母-胎免疫识别低下型，选择标准参见文献［4］。将40例RSA随机分为两组，供者组与配偶组各20例。比较新生儿体重的对照组，为在本院同期无妊娠并发症及妊娠合并症足月分娩的新生儿。
　　二、免疫方法
　　供者组：采用供者白细胞静脉免疫疗法，输注红细胞血型一致的红白细胞混悬液4个单位。配偶组：采用配偶白细胞皮内加静脉免疫疗法, 白细胞总数平均为2.74×107/次。两组均间隔4周免疫1次, 免疫3次为1疗程, 末次免疫后2周复查封闭抗体。封闭效率(MLR-BE)仍未升高者加强免疫1次, 直至封闭抗体明显升高。两组患者封闭抗体水平在免疫前经统计学检验差异无显著性。
　　在发现患者封闭抗体升高后，安排受孕；并于妊娠35天加强免疫1次，此后每间隔4周加强免疫1次，直至孕16周。妊娠16周后一般不需加强免疫。
　　三、观察方法
　　1. MLR-BE: 以单向混合淋巴细胞反应封闭试验检测MLR-BE，方法参见文献［3］并对其进行改进：以丝裂霉素处理的男方外周血淋巴细胞作为刺激细胞(1×106/ml，0.1 ml); 以患者外周血淋巴细胞作为反应细胞(1×106/ml，0.1 ml), 将刺激细胞与等量患者血清于37℃水浴1小时后, 去上清。以未经患者血清处理的刺激细胞为对照, 在含有25%正常AB型血清中, 与反应细胞于5% CO2、37℃孵育5天后，加3H-TdR 0.6 μCi/孔, 继续培养18小时后,收样分别测定各孔放射性核素每分钟闪烁记数(min-1)值。按下式计算MLR-BE：

MLR-BE=(1-(A)/(B))×100%

　　A: 刺激细胞与患者血清作用后, 加反应细胞在25%AB型血清中培养的min-1值
　　B: 刺激细胞加反应细胞在25%AB型血清中培养的min-1值
　　2. 抗封闭抗体的独特型抗体: 以单向混合淋巴细胞反应封闭抑制试验检测抗封闭抗体的独特型抗体。在MLR-BE 实验方法基础上, 增加在25%患者血清中混合淋巴细胞培养，以分析患者血清中可能存在的抗封闭抗体的独特型抗体对MLR-BE的作用。按下式计算抗封闭抗体的独特型抗体:

抗封闭抗体的独特型抗体 = (C-A)/(B)×100%

　　C: 刺激细胞与反应细胞在患者血清中培养的min-1值
　　3. 细胞毒指数(CI): 参见文献［3］: 取微量细胞毒试验板, 分别设定加补体的不加待检血清及加待检血清不加补体的阴性对照,及加抗人淋巴细胞血清(ALS)并加补体的阳性对照; 以男方外周血淋巴细胞作为指示细胞,按标准细胞毒试验法检测患者血清中作用于男方淋巴细胞膜表面抗原的细胞毒抗体。按下式计算CI:

CI=(样品平均死细胞率-阴性对照平均死细胞率)/
(100%- 阴性对照平均死细胞率)×100%

4. 封闭抗体的流式细胞分析: 参见文献［5］。以男方外周血淋巴细胞为抗原靶标，以正常人AB型血清为对照, 分析患者血清中封闭抗体对CD3、CD4及CD8抗原的作用。按下式分别计算抗CD抗原的封闭效率(抗CD-BE):　　

抗CD-BE＝加AB型血清CD比例-
加患者血清CD比例(%)

四、统计学分析方法
　　计量资料均数采用t检验，应用SPSS/PC+统计学软件处理系统。 计数资料行χ2检验。

结果

　　一、免疫后两组封闭抗体的动态变化
　　母胎同种免疫识别低下型 RSA经供者或配偶白细胞免疫后，反映封闭抗体的各项指标均显示不同程度的上升趋势，特别是MLR-BE、MLR-BE抗独特型抗体、抗CD3-BE及抗CD4-BE在免疫后显著升高。其封闭抗体动态变化情况见表1。
　　二、供者及配偶白细胞免疫疗效的比较
　　经供者白细胞静脉免疫及配偶白细胞皮内加静脉免疫治疗后，反映封闭抗体的各项指标均呈现明显升高趋势。根据封闭抗体动态变化分析，配偶白

表1　白细胞免疫前后封闭抗体的动态变化（%，±s）
　　封闭抗体 免疫前 免疫次数
3 4 5 6 7
MLR-BE

-85.1±20.1*

7.9±11.8

44.8±10.5

34.8±17.0

30.6±13.6

38.8±19.2
MLR-BE抗独特型 -63.7±14.8* -15.9±　6.4 36.4±38.6 -21.6±15.9 -12.6±　8.4 -17.1±　9.5
CI 13.7±　2.0* 20.3±　3.4 25.9±　3.5 29.3±　4.5 12.2±　3.3
抗CD3-BE -0.9±　1.2** 14.6±　4.9 12.6±　8.6 10.5±　3.6 6.7±　4.3
抗CD4-BE -8.1±　2.6* 3.1±　3.0 -8.7±　7.0 6.5±　4.6 9.5±　7.5
抗CD8-BE -1.5±　4.1 5.0±　2.0 4.6±　6.4 5.2±　2.0 4.6±　3.6
抗CD4-BE/抗CD8-BE -6.6±　3.6 -1.9±　2.9 -13.3±　4.2 1.2±　5.1 4.9±　5.5
　　*与免疫后比较，P<0.01　　**与免疫后比较，P<0.05

表2　供者及配偶白细胞免疫后封闭抗体的动态变化比较(±s)
组别 封闭抗体
(%)		 免疫前 免疫次数
3 4 5 6 7
供者组
　 MLR-BE

-85.6±23.7

-9.7±20.9

35.8±13.2

46.4±21.5

26.5±29.7

21.0±53.0
　 MLR-BE抗独特型 -66.3±26.7 -20.7±12.9 10.4±19.1 -44.1±27.0 -29.3±14.9 -28.6±31.2
　 CI 11.3±　1.9 17.5±　4.7 25.2±　3.7 17.0±11.9 1.57±　4.7 19.2±　2.0
　 抗CD3-BE -1.0±　2.0 8.4±　3.5 14.0±10.4 12.5±　4.3
　 抗CD4-BE -7.1±　2.3 -1.4±　2.8 -11.0±　8.1 4.3±　4.4
　 抗CD8-BE 2.5±　3.9 3.9±　2.3 3.5±　7.7 6.4±　2.3
　 抗CD4-BE/抗CD8-BE -9.7±　4.4 -5.3±　4.6 -14.4±　4.9 -4.6±　5.1
配偶组
　 MLR-BE -90.6±33.6 16.7±　3.4 65.4±11.8 28.5±32.8 33.5±12.1 47.7±19.4
　 MLR-BE抗独特型 -61.7±17.1 -16.9±　7.1 86.9±94.9 -27.2±16.9 -5.5±　9.5 -11.3±　5.3
　 CI 11.3±　1.9 19.4±　4.8 26.9±　9.6 31.7±10.6 18.9±　8.3 8.7±　3.7
　 抗CD3-BE -0.7±　1.2 20.8±　9.0 　 3.3±　2.6 6.7±　4.3
　 抗CD4-BE -9.1±　5.2 7.6±　5.1 　 14.2±16.0 9.5±　7.5
　 抗CD8-BE -6.2±　7.7 6.0±　3.3 　 1.1±　3.4 4.6±　3.6
　 抗CD4-BE/抗CD8-BE -2.9±　6.0 1.6±　3.4 　 13.2±12.6 4.9±　5.5


细胞免疫疗法似优于供者白细胞免疫疗法；且前者免疫后封闭抗体对CD抗原的作用(如抗CD4-BE, 抗CD4-BE/抗CD8-BE)强于后者。供者组与配偶组免疫后MLR-BE、MLR-BE抗独特型、CI、抗CD3-BE、抗CD4-BE、抗CD8-BE、抗CD4-BE/抗CD8-BE比较见表2。
　　三、供者及配偶白细胞免疫的临床疗效
　　经白细胞免疫治疗后,再次妊娠足月分娩率为86.2%; 其中供者组为86.7%,配偶组为85.7%, 两者比较，差异无显著性(P>0.05)。见表3。

表3　供者及配偶白细胞免疫的临床疗效分析
组别 总例数 受孕例数 妊娠预后
足月分娩例数 足月分娩率(%)
供者组　 20 　15 13 86.7
配偶组 20 14 12 85.7
合计 40 29 25 86.2

　　供者或配偶白细胞免疫后的新生儿体重见表4。与同期无妊娠并发症及妊娠合并症正常分娩的新生儿体重比较，差异无显著性(P>0.05)。由此可见, 白细胞免疫疗法对新生儿体重无明显影响。

表4　供者及配偶白细胞免疫后足月产新生儿体重(±s)
组别 　　例数 新生儿体重(g)
供者组

10*

 3 400.1±123.1
配偶组 6* 3 132.8±173.4
对照组 55 3 279.0±113.8
　　*仅将在本院分娩的统计在内

讨论

　　一、母胎免疫识别低下型RSA的免疫治疗方法
　　封闭抗体缺乏，显示母-胎同种免疫识别功能低下，是RSA的主要病因。针对封闭抗体缺乏RSA的免疫治疗, 国际上主要采用供者或配偶白细胞免疫疗法及静脉大剂量免疫球蛋白疗法［6～9］。前者对孕早期流产即原发性流产有效［6，7］；后者主要对孕中、晚期宫内胎儿死亡即继发性流产有效［8，9］。这两种免疫治疗的目的均是增加RSA患者体内封闭抗体水平, 前者通过主动免疫刺激患者主动产生有利于胎儿胎盘单位存活的封闭抗体；后者则主要通过被动免疫提供给患者封闭抗体，使随后发生的妊娠得以成功。
　　二、供者及配偶白细胞免疫后封闭抗体及抗其独特型抗体变化规律
　　结果显示，供者白细胞经静脉免疫及配偶白细胞皮内加静脉免疫两种方法，均能有效地刺激患者产生封闭抗体。随着免疫次数的增加，封闭抗体呈明显升高趋势。比较两种免疫方法的疗效显示，配偶白细胞免疫疗法稍优于供者白细胞免疫；MLR-BE抗独特型抗体亦显示出类似趋势。
　　抗CD-BE是反映封闭抗体对有关CD抗原可能的生物学作用，经3～6次供者或配偶白细胞免疫后，抗CD3-BE、抗CD4-BE、抗CD8-BE及抗CD4-BE/抗CD8-BE均呈现不同程度的升高。我们以前的研究结果显示，抗CD3-BE及抗CD4-BE在正常母胎免疫调节中起重要作用［5］。治疗后，抗CD3-BE、抗CD4-BE及抗CD4-BE/抗CD8-BE升高与否可能是母胎免疫识别低下型RSA治疗成功的重要指标。比较两种免疫疗法治疗后的抗CD3-BE、抗CD4-BE及抗CD4-BE/抗CD8-BE升高趋势显示，配偶白细胞免疫疗法似优于供者白细胞免疫疗法。
　　三、白细胞免疫治疗致成功妊娠的机理
　　白细胞免疫疗法能刺激RSA患者产生足够的封闭抗体，这是使随后发生的妊娠能得以成功的主要理论依据［7］。本研究结果显示，经3～5次白细胞免疫后，患者封闭抗体及抗其独特型抗体水平明显升高。其升高的封闭抗体主要作用于母胎界面局部，从而发挥保护胎儿胎盘单位的作用。封闭抗体抗独特型抗体由于其“内影像”结构，与滋养细胞等细胞表面抗原表位同源，因而它不仅在母胎免疫界面局部，而且在体循环，与那些对胎儿胎盘单位有害的免疫活性细胞(如Tc及NK细胞等)及有关因子如白细胞介素2(IL-2)等产生作用, 进而构成胎儿胎盘单位的重要免疫保护网络。我们在前期研究工作中发现，白细胞免疫疗法能使患者CD4细胞及CD4/CD8比例明显上升，IL-2活性明显下降［4］。这种外周免疫功能的变化，可能通过抗封闭抗体独特型所介导，有利于促进母体对胚胎的免疫保护及抑制母体对胚胎的免疫损伤，最终有利于妊娠成功。

参考文献

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　3　李大金, 朱影，王明雁，等. 反复自然流产的免疫流行病学研究. 中华医学杂志, 1998, 78:94-97.
　4　李大金, 李超荆. 原发性反复自然流产白细胞免疫疗法的细胞免疫功能动态变化.上海医科大学学报, 1996， 23:101-102.
　5　李大金, 李超荆，朱影，等. 流产患者的封闭抗体对配偶T淋巴细胞CD抗原的影响. 中华医学杂志, 1994，74:568-569.
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　8　Mueller-Eckhardt G. Immunotherapy with intravenous immunoglobulin for prevention of recurrent pregnancy loss: European experience. Am J Reprod Immunol, 1994, 32:281-285.
　9　Coulam CB. Immunotherapy with intravenous immunoglobulin for treatment of recurrent pregnancy loss: American experiences. Am J Reprod Immunol, 1994, 32:286-289.

　　作者单位：200011 上海医科大学妇产科研究所生殖免疫室

(收稿：1997-10-28　　修回：1998-07-07)

(本文编辑：姜民慧)