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阻断乙型肝炎病毒母婴宫内传播对血清HBV DNA和转录体的影响 王清图 修 霞
郭 永 王爱婷
齐峰（潍坊市妇幼保健院、潍坊市泰和医院 261011） 苏
勤 张 伟 刘 节
（第四军医大学唐都医院病理科 陕西省西安市 710038） [摘要]
目的 探讨不同方法阻断乙型肝炎病毒母婴垂直传播的效果，明确携带乙肝病毒健康生育期妇女干预治疗对保护婴儿抗-HBV感染的意义。方法
设计了对慢性携带HBV孕妇进行治疗性干预、对其高危新生儿正常免疫的治疗方案。将60例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分成二组，HBIG与左旋咪唑涂布剂治疗组31例，未治疗组29例。治疗组均在孕26周起开始注射，孕妇和新生儿血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc检测采用ELISA法，HBV
DNA及全长型和顿挫性转录体测定用PCR电泳和RT－PCR法。孕妇与新生儿血清双盲法测定病毒DNA及不同的病毒转录体分子，分析母婴之间乙肝病毒分子水平上的关系。结果
母血中HBsAg/HBeAg阳性者，其新生儿外周血中HBsAg阳性率：治疗组2/31例，宫内感染率为6.45%。未治疗组4/29例，宫内感染率13.7%。孕妇治疗性干预有明显的阻断乙肝病毒宫内感染效果，与对照组比较分别有极其显著的差异（P＜0.01＝。无论治疗组还是对照组，都有超过一半的患儿携带顿挫型病毒转录体。结论
携带HBV孕妇于孕晚期给HBIG和左旋咪唑涂布剂联合治疗后，可有效降低婴儿HBsAg和HBV
DNA携带率。 [关键词]：阻断;乙型肝炎病毒;宫内传播；左旋咪唑涂布剂；乙肝免疫球蛋白；病毒转录体 A
preventive study on the vertical transmission of hepatitis B virus demonstrated
by seroassays for viral transcripts, DNA and proteins WANG
Qingtu，XIU Xia，GUO Yong，QI Feng. Weifang City Maternal and Child Health Hospital, Weifang,
Shandong 261011 SU
Qin, ZHANG Wei, LIU Jie. Department of Pathology, Tangdu Hospital, The Fourth
Military Medical University, Xi’an, Shaanxi 710038 【Abstract】 Objective
To further investigate the preventive effects on different intervention
approaches on mother-infant vertical transmission of Hepatitis B virus (HBV). Methods Sixty cases chronic HBsAg-carriers in pregnancy were divided
into two groups. Thirty-one cases received anti-HBV immunoglobulin injections
and levamisole liniment since the 26th week of gestation；29
cases did not receive the treatment and were regarded as a reference group. HBV
seromarkers, including HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb and HBcAb, were examined by
ELISA. The viral DNA and different types of transcripts in the sera were
detected using PCR and RT-PCR, respectively. Results
The seropositivity rates for HBsAg, viral DNA and full-length and
trucated transcripts in babies from the treatment and reference groups were
6.45%, 3.2%, 3.2%, 54.8 and 13.7%, 6.3%, 12.5%, 62.5, respectively, with the
first four parameters, rather than the last one, being significantly lower in
the former group than those in the latter. Conclusion
The intervention therapy with immunoglobulin injections and levamisole liniment
during pregnancy seems preventive on the vertical transmission of HBsAg, viral
DNA and full-length transcripts, rather than that of the truncated viral
transcripts. 【Key words】preventive intervention; Hepatitis B virus; vertical
transmission; levamisole liniment; HBV immunoglobulin；viral transcript 孕妇携带的乙型肝炎病毒（HBV）可垂直传播感染新生儿，目前分娩时采取的一系列防范措施，尚不能完全阻止母婴垂直传播[1]。宫内感染是母婴传播的主要途径，是导致婴儿出生后乙肝疫苗(HBVac)接种失败的主要原因[2]，因此，阻断母婴传播成为控制乙肝流行的关键环节。我们用HBVac、乙肝免疫球蛋白（HBIG）和左旋咪唑涂布剂(levamisole
liniment)联合方案探讨阻断HBV宫内传播的临床疗效，取得较好的效果，乙肝病毒携带呈“大三阳”
孕妇所生婴儿阻断率达80％以上［3］。本文报告不同阻断方法对HbsAg、HBV
DNA和转录体的影响。 资料与方法 ⒈研究对象：2000年1月1日至2002年12月，我院产科门诊于孕20周开始门诊检查血清乙肝病毒标志物（HBVM），观察HBsAg/HBeAg阳性60例，经孕期干预，并住院分娩进行分组观察分析。60例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分为治疗组31例及未治疗组29例，观察新生儿与母亲外周血中HBVM、DNA以及不同类型病毒转录体的变化，评价干预措施的效果。 60例孕妇孕期均无先兆流产史，无急性或慢性肝炎病史、症状及体征，无肝功能受损情况。孕妇年龄、孕产次、胎龄均无明显差异。60例孕妇分娩新生儿60名，男32女28例。 ⒉60例HBsAg/HBeAg阳性孕妇治疗方法：孕26周开始按来诊次序分为：治疗组31例：孕26周始孕妇每4周1次臂大肌注射HBIG
（上海生物制品研究所生产，批号为20000712）200 IU，同时使用左旋咪唑涤布剂（福建省凯华药业有限公司生产,批号为20000307，500mg/支）5ml涂布于上、下肢体内侧皮肤易吸收处，每周2次，3个月一疗程，未治疗组29例，根据病人或其亲属的意见未给予上述任何主动或被动免疫防治措施，孕妇所生的新生儿的乙肝疫苗接种均按第0、1、6月进行。 统计学处理：计量资料采用ｔ检验。 ⒊血清学检测：孕妇20～26周抽取肘静脉血2
ml，新生儿分娩24小时内采股静脉血2 ml。送我院中心实验室分离血清，检测HBVM采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）；试剂盒由上海科华生物技术有限公司提供。同份标本低温冰冻（－50℃）保存，按以前的方法［4，5］自血清中提取病毒核酸，每次提取用血清200
μL，提取物终体积为50μL。经PCR及RT-PCR进行扩增，经琼脂糖电泳显示产物。 4.病毒DNA的PCR扩增：上游引物为txs(1445):
5’-GGA CCG TGT GCA CTT CGC TT-3’，下游引物为txas(1574): 5’-CCT CAA
GGT CGG TCG AC-3’。取2μL提取物，在含有引物对txs/txas的50μL反应体系中应用Tag
DNA聚合酶(Gibco BRL, Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)按标准条件扩增35个循环。应用fRNA的cDNA质粒pMT9T40A
(200 pg)和trRNA的cDNA质粒pMT9T41A (200 pg)作为阳性对照，用水作为阴性对照。 5.逆转录后通过半巢式PCR检测HBV
RNA 3’端结构：我们以前的结果［4，5］表明，由于锚定Oligo
d(T)引物能够特异的扩增poly(A) RNA，检测病毒RNA的3’端结构的反应不需要Dnase
I预处理标本；trRNA扩增用的Oligo d(T)引物与fRNA末端1803－1806位置的结构也有一定的亲和力，因此本研究用trRNA
RT-PCR这一个反应同时显示trRNA和fRNA两种转录体分子，与其产物大小分别为235bp和360bp。第一轮反应上游引物为txs；第二轮反应上游引物为txs2(1464):
5’TCA CCT CTG CAC GTC GCA TG;共用锚定引物为txas5(1683): 5’-(T)15GCT
GG-3’。应用50μL单管RT-PCR系统(Roche, Mannheim, Germany)进行逆转录和扩增。为了表明血清中RNA的广泛存在和其分子的相对完整性，应用含有引物对GAPDH1／GAPDH2的RT-PCR体系对相同的标本中3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）RNA进行逆转录和扩增。所用上游引物为：GAPDH1（3755）：
5’-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3’；下游引物为：GAPDH2（4344）：
5’-GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT-3’。为了进一步显示反应的扩增效率及特异性，始终应用质粒DNA
pMT9T40A和pMT9T41A进行平行扩增，前者为fRNA RT-PCR阳性而trRNA反应阴性；后者为fRNA
反应阴性而trRNA反应阳性。此外，去离子水和18S／22S核糖体RNA也被用来作为阴性对照，应用Kwok和Higuchi的方法[6]避免实验室内污染，并把所有的反应至少重复一次。 6.扩增产物的检测：把产物（15μL）上样到含溴化乙锭（0.2
μg/mL）的琼脂糖凝胶（2％）进行电泳，紫外线下观察，分别用UVP凝胶分析系统和光学照相记录数据，用应用软件（LabWork
3.0 UVP）评价产物的强度。 结
果 ⒈治疗组与非治疗组孕妇所生新生儿HBVM的比较 治疗组共31例。孕妇均接受乙肝免疫球蛋白200
UI／月，共四次，左旋咪唑涂布剂治疗500
mg／支，每周三次，涂布四肢内侧皮肤3个月治疗，治疗过程中无不良反应，足月分娩。新生儿出生后48小时内、接种乙肝疫苗前采集外周血检测HBVM，其中HBsAg阳性2例（6.45
%）。外周血抗-HBs阳性10例（32％）。未治疗组共29例：未接受任何主动或被动免疫防治措施，足月妊娠分娩。新生儿娩出后48小时内采集外周血送检，其中HBsAg阳性4例。（13.7
%）。外周血抗-HBs阳性7例（24％）。两组比较，治疗组HbsAg阳性病例少于未治疗组，HbsAb阳性病例多于未治疗组（见表1，p<0.01）。 表1.新生儿外周血HBVM ————————————————————————————— 组
别 例数HBsAg (+) HBsAb
(+) HBeAg (+)
HBeAb (+) HBcAb (+) —————————————————————————————— 治疗组
31
2
10
1
2
16 未治疗组
29
4
7 1
0
8 —————————————————————————————— 2．两组孕妇与新生儿血清中HBV DNA、fRNA (全长型)、trRNA（顿挫型）的比较（p<0.01） 对未治疗组血清标本16对，治疗组送检标本31对，进行HBV
DNA及fRNA、trRNA等不同类型病毒转录体的检测，结果见表2。 表2.新生／母亲外周血HBV
DNA、fRNA、trRNA的比较 ————————————————————————————————— 组
别 检测例数
DNA
fRNA trRNA ————————————————————————————————— 治疗组
31 1／18
1／14
17／17 未治疗组
16 1／6
2／4
10／10 ————————————————————————————————— 未治疗组HBsA
g/HBeAg阳性孕妇４例中病毒DNA强阳性（+++）３例，fRNA强阳性（+++）2例，trRNA阳性(+～++)3例。所生婴儿2男2女，HBeAg/抗－HBc阳性2例，抗－HBc阳性1例，无HBV
DNA和fRNA阳性例，但4例全呈trRNA阳性（+）。12例HBsAg/抗－HBc阳性孕妇中，HBV
DNA阳性3例，fRNA阳性（+++）2例，trRNA阳性（+～+++）7例。所生婴儿8男4女，HBsAg阳性2例，抗－HBe／抗－HBc阳性4例，HBV
DNA阳性1例，fRNA阳性例2例（+），trRNA阳性（+～++）6例。即本组16例新生儿中，HBV
DNA阳性1例（6％），fRNA阳性2例（12.5％），trRNA阳性10例（62％％），其中1例为HBVDNA（+）、fRNA（+）、trRNA（++）。 治疗组31例孕妇中HBsAg/HBeAg／抗－HBc阳性16例，其中HBV
DNA阳性（+++）12例，fRNA阳性（++～+++）11例，trRNA阳性（+～++）11例；所生婴儿7男9女，HBsAg/抗－HBc阳性合并HBV
DNA阳性1例，抗－HBs或抗－HBs/抗－HBe阳性11例，fRNA弱阳性例1例（+），trRNA弱阳性（+／－）11例。HBsAg/抗－HBe／抗－HBc阳性15例，HBV
DNA阳性6例，fRNA阳性例（+++）3例,trRNA阳性（+～+++）6例；所生7男8女，抗－HBs阳性3例，抗－HBc阳性6例，无HBV
DNA和fRNA阳性例，trRNA阳性（+～+++）6例。即本组婴儿血清HBsAg/抗－HBc阳性合并HBV
DNA阳性1例（3％），fRNA弱阳性例1例（+），trRNA阳性17例（55％）。 讨
论 1、对HBsAg阳性孕妇行主动和被动免疫，可以有效降低宫内感染率。本组资料中，乙肝病毒携带状态呈HBsAg阳性者中，未治疗组孕妇其新生儿外周血HBsAg阳性者占13.7%，治疗组为6.45%。未治疗组与各治疗组比较有极其显著的差异（P<0.01）。已有研究表明乙肝免疫球蛋白对阻断乙肝病毒母婴传播有一定作用，孕妇产前多次注射HBIG能有效减少HBV的宫内感染[3]；左旋咪唑是一种非特异性免疫调节剂，主要作用于T细胞，诱导早期前T细胞分化成熟，成为功能性T细胞并可使功能失调的T细胞恢复正常，同时增强单核细胞的趋化性和吞噬作用，激活巨噬细胞和粒细胞移动抑制因子，诱生内源性干扰素，提高免疫和病毒疗效，已经用于治疗慢性乙型肝炎[7]。本组资料提示，应用HBIG及左旋咪唑可明显降低宫内HBV感染。HBV母婴传播发生率与母体HBsAg的浓度以及是否有HBeAg有关。现认为在早期和中期妊娠时感染HBV常易清除，而很少发生宫内感染，晚期妊娠时母亲携带较大量HBV病毒者容易传染给胎儿，有人提出HBV经胎盘感染胎儿的可能时间为孕中期或孕晚期[8]。因此我们认为选择孕26周以后作为开始阻断HBV垂直传播的治疗时间较恰当。 2、母婴传播是形成慢性HBV感染的重要原因。据估计我国的慢性HBV感染约有30%～50%是通过母婴传播发生的。对于未接受治疗的母亲来讲，乙型肝炎表面抗原(HbsAg)单独阳性母亲的婴儿约40%在半岁内出现HBsAg阳性，而HBsAg和HBeAg双阳性母亲的婴儿HBsAg阳性率高达90%以上[9]。这些婴儿多变为慢性HBV感染，形成新的传染源。虽然α-干扰素和拉米夫定对慢性乙型肝炎有一定疗效,但远非理想。因此阻断HBV母婴传播对控制HBV流行及其相关疾病具有重要意义。 在高流行区，HBV多数于围产期或幼儿期通过母-婴垂直传播，容易慢性化[10]。慢性感染早期是病毒高复制阶段,常为HBeAg阳性，血中有高水平的病毒DNA。随着血清HBeAg转阴，血中病毒DNA随之减少，这种病例可检测到anti-HBeAg[11]。尽管血清中HBsAg相对稳定，每年也有约1%～2%自然转阴，这是HBV慢性感染的更晚期阶段。在某些病例，HBsAg转阴后一段时间内血液中仍存在anti-HbcAg[12]。我们的研究表明，fRNA与血中DNA水平和HBeAg密切相关。非治疗组母亲血清HBsAg/HBeAg/HBV
DNA和fRNA阳性者，其所生婴儿血清亦为阳性，干预治疗组母亲血清HBsAg/HBeAg/HBV
DNA和fRNA阳性者，其所生婴儿有1例亦为阳性。而无论非治疗组还是治疗组，虽然无HbeAg和HBV
DNA等病毒复制的证据，母血中抗－HBc阳性和trRNA阳性与婴儿血清中trRNA的阳性率却相当高（表2），这与苏勤等［4，5］认为TrRNA的存在与否与上述病毒复制指标没有明确相关性观点相一致。在迄今为止所有的HBV血清学指标中trRNA表现最稳定。染色体内整合的HBV
DNA可能是trRNA的主要转录模板。我们通过对比观察证实孕期应用HBIG及左旋咪唑可明显降低新生儿的HBsAg/HBeAg和HBV
DNA的感染率，但不能降低新生儿血液中trRNA的携带率，其意义值得进一步研究。乙肝宫内感染是一个复杂问题，除了与产程时间、分娩方式等有关外，乙肝病毒本身的变异已成为阻断其母婴传播的困难之一。是否母亲携带乙肝病毒者所生新生儿出生时检测RNA能早期发现HBV隐匿性感染[13]，并早做预防及治疗，有待深入观察。 参 考 文 献 ⒈王清图，修霞.
乙肝病毒宫内感染及阻断母婴垂直传播的研究．临床肝胆病杂志
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SL,Han XB and Yue YF .Relationship between HBV viremia level of pregnant women
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;电话：0536－8319609 本文2003年4月23日投寄世界华人消化杂志。 |
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