近30年来，关于体外化疗药物敏感性测定方法的研究异常活跃，但由于各种技术上的限制，使药敏检测结果与临床治疗反应之间出现很大差异，如何消除肿瘤组织中多种正常细胞成分的干扰，是解决这一问题的关键。由于端粒酶在正常细胞与恶性肿瘤细胞中表达水平存在差异，如果端粒酶活性改变能作为判断化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应，则端粒酶将有望成为一种新的体外药物敏感性检测指标，极大地提高检测结果的准确性及可靠性。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1卵巢上皮性癌细胞系SKOV3：SKOV3细胞端粒酶呈阳性，确定肿瘤细胞数量与端粒酶活性水平之间的关系，有助于判断中由于卵巢上皮性癌组织原代培养细胞中存在不均质性，既有肿瘤细胞，又有其他成分的细胞，由中国医学科学院天津血液病研究所药物室提供，在RPMI1640加10%胎牛血清，37℃5%CO₂饱和湿度环境下培养传代。

1.1.2 卵巢上皮性癌组织的原代培养：22例卵巢上皮性癌组织标本，取自1998年11月～1999年8月期间在天津医科大学总医院妇科手术的患者，均为卵巢浆液性腺癌，手术分期为Ⅰ期者1例，Ⅱ期者2例，Ⅲ期者16例，Ⅳ期者3例。

1.1.3 主要试剂：端粒酶检测试剂盒购自德国宝灵曼(Boehringer Mannheim)公司。

1.2 方法

1.2.1 SKOV3细胞数量与端粒酶活性的关系：选择处于对数生长期的SKOV3细胞系，按等比稀释，浓度分别为5×10⁵/ml、2.5×10⁵/ml、1.25×10⁵/ml、6.25×10⁴/ml、3.125×10⁴/ml、1.56×10⁴/ml、7.8×10³/ml，分别取2ml接种于6孔板，以上述方法测定端粒酶活性。

1.2.2 端粒酶活性检测：以Trap-PCR-ELISA法检测卵巢上皮性癌中端粒酶活性，方法按试剂盒要求操作,标准阴性对照值（A₄₅₀-A₆₉₀）应小于0.25U，标准阳性对照值（A₄₅₀-A₆₉₀）应大于1.5U，当△A＞0.2U判断为阳性。

1.2.3 加药后原代培养细胞中端粒酶活性变化：调整细胞浓度为1×10⁵/ml，取2ml接种于6孔板，继续培养12小时，加入CDDP 10μg/ml、ADM 1μg/ml，继续培养72小时终止，测定端粒酶活性。

1.2.4 MTT法测定肿瘤细胞抑制率：按文献方法操作^[1]。CDDP 10μg/ml、ADM 1μg/ml，每组设24个重复孔。按以下公式计算肿瘤细胞抑制率。当抑制率≥30% 时,为药物敏感；抑制率<30% 时为药物不敏感。

肿瘤细胞抑制率（%）=（1-实验组A_546nm / 对照组A_546nm ）× 100%

1.3 统计学分析

经SPSS统计软件包进行处理，统计学方法为χ²检验及t检验。

2.结果

2.1 SKOV3细胞数量与端粒酶活性的关系

SKOV3细胞浓度分别为5×10⁵/ml、2.5×10⁵/ml、1.25×10⁵/ml、6.25×10⁴/ml、3.125×10⁴/ml、1.56×10⁴/ml、7.8×10³/ml、3.9×10³/ml，端粒酶活性分别为2.174U、2.089U、1.732U、1.656U、1.339U、1.142U、0.765U、0.256U。经相关分析，SKOV3细胞数量与端粒酶活形呈正相关，即卵巢癌活细胞数量越多，端粒酶活性越高。

2.2 卵巢上皮性癌中端粒酶活性与药物敏感性

2.2.1卵巢上皮性癌组织中端粒酶活性与药物敏感性：22例患者均经PAC（CDDP+ADM+CTX）方案化疗，随访12～24个月。其中2例死亡，3例复发，1例进展，其余18例治疗有效。

22例卵巢上皮性癌组织中，端粒酶阳性者19例（86.36%），阴性者3例（13.64%）。其中原代培养成功者仅11例，端粒酶活性高于2U者6例（55%），均对CDDP不敏感（100%），4例（66.67%）对ADM不敏感，而在5例低于2U者，仅1例（20%）对CDDP不敏感，对ADM均敏感。提示随着端粒酶活性水平的增高，卵巢上皮性癌对CDDP及ADM的敏感性降低（χ²=7.54，p<0.01；χ²=5.24，p<0.01）。

2.2.2用药前后端粒酶活性变化与卵巢上皮性癌药物敏感性的关系：在11例原代培养卵巢上皮性癌中，加入CDDP、ADM前后端粒酶活性下降在30%以上者分别有9例（81.82%）、9例（81.82%），端粒酶活性下降低于30%者分别有2例（18.18%）、2例（18.18%）。以MTT法测定肿瘤细胞CDDP、ADM生长抑制率，分别在30%以上者分别有4例（36.36%）、7例（63.64%），而生长抑制率低于30%者分别有7例（63.64%）、4例（36.36%）。与临床疗效相比，以端粒酶活性下降法及MTT法测定卵巢上皮性癌对CDDP及ADM敏感性与临床疗效符合率分别为90.91%、63.64%及90.91%、72.73%。显然，端粒酶活性下降法较MTT法临床符合率高，但经χ²检验，两种方法间无统计学差异（p<0.05）。

3.讨论

3.1 卵巢上皮性癌中端粒酶表达对化疗敏感性的影响

在11例原代培养卵巢上皮性癌组织中，端粒酶均为阳性。6例端粒酶活性高于2U的患者，经MTT法证实100%对CDDP不敏感、66.67%对ADM不敏感，而在低于2U的患者中，均对CDDP、ADM敏感，临床随访发现其符合率分别为50%、100%。提示端粒酶活性显著提高不仅与卵巢上皮性癌的发生有关，而且对卵巢上皮性癌的化疗敏感性有显著影响，这可能是造成患者预后不良的原因之一。

3.2 以端粒酶活性改变作为卵巢上皮性癌药物敏感性指标的可行性

MTT法是目前临床常用的体外检测不同化疗药物敏感性的方法，具有简便、快速、高效，无需特殊仪器设备等特点，自从建立以来便成为临床常用的药敏检测方法。但长期实践证实，该方法也存在很大局限性。众所周知，肿瘤组织中存在细胞异质性，其中正常细胞含量可影响药物敏感性。在不同的肿瘤组织中，即使肿瘤病理类型相同、细胞总量相同、所用药物剂量相同，但由于肿瘤细胞在组织中的比例及其与药物分子之间比率不同，因此所得结果并不能真正反映肿瘤细胞对药物的实际敏感性。MTT法本身不能区别化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用及其对非肿瘤细胞的杀伤作用。另一方面，在化疗药物作用后72小时，部分死亡肿瘤细胞中仍有25%的琥珀酸脱氢酶活性，并能使MTT显色，从而影响结果的稳定性与可靠性。此外，实验所用DMSO对人体健康及实验器材均有一定的不良影响，因此也限制了该法在临床的应用。

许多研究发现，大多数肿瘤组织中端粒酶阳性率高达85%～90%，而在相同来源的组织，甚至癌旁组织中端粒酶均为阴性^[2-4]。这一发现促使我们去探索一种更能客观反映肿瘤细胞在体外对药物敏感性的方法。本研究结果证实，在22例卵巢上皮性癌中，端粒酶阳性率为86.36%。卵巢上皮性癌SKOV3细胞数量与端粒酶活性呈正相关。在抗癌药物作用后测定肿瘤细胞中端粒酶活性变化，能反映残余肿瘤细胞的生长活性，可作为肿瘤细胞生存的指标。端粒酶活性下降与肿瘤细胞抑制程度成正比，在化疗药物作用前后检测端粒酶活性改变可作为确定化疗药物在体外对肿瘤细胞杀伤效率的一种客观指标。在耐药肿瘤细胞中，抗癌药物不能引起端粒酶活性下降及肿瘤细胞生长抑制。此外，以端粒酶活性变化作为检测药物敏感性指标的方法与MTT法相比，不受肿瘤细胞数量及其他非肿瘤细胞成分的限制。因为该法所需肿瘤细胞数较少，1000个肿瘤细胞即可检测出端粒酶活性。以不同化疗药物处理卵巢上皮性癌原代培养细胞时，测定处理前后细胞提取液中端粒酶活性的改变，可客观反映肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度，而正常细胞的存在对端粒酶活性的改变并不产生影响。所以实验结果可靠，特异性强，可指导临床选择用药。

以端粒酶作为卵巢上皮性癌药物敏感性测定指标的半定量方法，与MTT法相比，临床符合率更高，可有针对性地选择敏感药物进行个体化治疗，具有较高的临床应用价值。而且随着端粒酶检测灵敏度的不断提高及其方法的不断简化，以端粒酶活性水平变化作为卵巢上皮性癌药物敏感性指标将有希望成为一种准确而可靠的体外药敏检测新方法。

参考文献

1.鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社.1995.p436

2.Oishi T, Kigawa J, Minagawa Y, et al. Alteration of telomerase activity associated with development and extension of epithelial ovarian cancer. Obstet Gynecol. 1998;91:568-571

3.Kyo S, Kanaya T, takakura M, et al. Expression of human telomerase subuint in ovarian malignant,borderline and benign tumors. Int. J.Cancer. 1999;80:804-809

4.Shay TW, Bacchetti S.A survey of Telomerase Activity in human Cancer. Euroean Journal of Cancer 1997;33:787-791

5: Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.  2004 Jun;12(3):304-8.