第六节  内分泌学激素测定技术的概述

内分泌疾病的正确诊断与治疗，能得以不断提高，是与内分泌功能检查及激素测定等分析技术迅速发展分不开的。各种新技术的应用都促使内分泌学的飞跃发展。随着现代科学技术不断发展，其检查方法也不断更新和提高。目前内分泌学检查方法有先进的影像学方法，包括电子计算机横断扫描（CT）、核磁共振显象（magnetic resonance imaging,MRI）、各种超声诊断方法等。本节重点介绍内分泌激素测定。

内分泌激素的测定方法

一、 生物测定法
    是传统的测定方法，它是用动物体内实验或其离体器官、组织、细胞和激素受体的体外实验，直接测定激素的生物活性，其优点是直接反映激素的生物活性。该方法是在相同条件下比较待测定样品和标准品产生相同效应的剂量比值。标准品与待测样品性质要相同或近似，其实验数据要根据生物变异规律和设计原理进行统计学处理。生物活性测定包括以下几种方法：
（一） 动物体内的测定方法
是用整体或切除某一内分泌腺体的小鼠、大鼠、豚鼠、猫、犬和兔等动物，按规定剂量及途径给予动物标准品和待测样品，根据产生同样生物效应，比较标准品和待测样品比值，推知待测样品的生物活性。该方法适用于药用激素测定。其优点可直接反映激素的生物活性，而其缺点是标本量大、动物多，受动物种属、来源、体质、年龄及性别等因素影响反应的灵敏度和准确性。
（二） 细胞生物化学方法不仅保持生物活性，并且可定量测定。
（三） 离体细胞培养测定生物活性法
    是通过体外培养原代细胞或细胞株，加入激素标准与激素样品，产生的生物功能改变，得知激素样品的生物活性，该方法适于小样品激素活性的测定，是研究激素功能与结构关系及其影响因素的较好方法。
（四） 放射受体分析法（radioreceptor assay,RRA）
是利用过量的放射性核素标记配体和非标记的配体，如激素的放射性核素标记物和激素样品在一定条件下，竞争有限的特异受体结合位置的方法。利用放射受体分析法计算激素受体的相对结合亲和力，可以推知待测样品有无激素生物活性。RRA方法只代表激素与受体结合亲和力，并不能准确反应激素结合后的生物活性，RRA值与生物活性是成正比关系。
二、 免疫测定法
（一） 凝集试验
    是利用颗粒抗原直接与抗体反应发生凝集现象称为直接凝集反应。若将一些可溶性抗原（或抗体）吸附在惰性颗粒载体表面上，与相应抗体（或抗原）发生凝集反应，称作间接凝集反应。抗原与颗粒载体相连接的称正向间接凝集反应。抗体与颗粒载体相连接的称反向间接凝集反应。这种方法用于早孕诊断的快速免疫胶乳法和羊红细胞血凝抑制试验。
（二） 免疫比浊法
此法分为两种，一种是胶乳比浊分析，是利用直径在15～600nm的化学胶乳颗粒作为抗原的包被物，提高抗原和抗体的结合物的浊度，用光度计可直接测定，灵敏度可达         10－8mol/L。另一种是直接比浊法，是使抗原和抗体的复合物在溶液中形成足够大的沉淀颗粒，可以用透射光或散射光比浊法分析，其灵敏度在10－8～10－3mol/L，上述方法用于血清、尿或脑脊液中含量较高的特殊蛋白测定。
（三） 标记免疫测定
它可分为抗原过量分析法和抗体过量分析法。在抗原过量分析法又分为放射性免疫分析法和非放射性免疫分析法
1．抗原过量分析法（饱和分析法或称竞争抑制分析法），其基本反应是标记抗原与未标记抗原竞争有限抗体或特异结合剂上的结合位点。
（1）放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）：是将同位素分析的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性的两大特点结合起来的一种微量测定技术。其原理是标记抗原与其特异抗体反应，产生标记抗原-抗体复合物，反应物与产物保持着可逆的动态平衡。如果在反应系统中同时存在非标记抗原，且标记与非标记抗原对于抗体是具有同样的亲和力，当抗体与标记抗原的量都是恒定时，抗原和标记抗原之和大于抗体上有效结合点的数目时，根据同位素稀释原理，随着抗原浓度的增加，标记抗原和抗体的复合物数量相应减少，则抗原与标记抗原和抗体的复合物之间存在着函数关系。因为标记抗原对抗体结合被未标记抗原的竞争结合所抑制，故产生一条抑制曲线。这条曲线反映了标记抗原结合程度或游离程度或者是二者之比与未标记抗原的函数关系，这一条曲线就是对样品进行定量的依据。RIA方法广泛应用于内分泌的各种激素，包括蛋白质、多肽和类固醇激素的测定，但必须记住“免疫反应”与生物活性并不是同义词，具有免疫反应部分，不一定具有生物活性。
（2）非放射性免疫测定法：是应用非同位素标记物，如酶标记物适用于样品中含有较高的被测物浓度的免疫测定法，还有一些非同位素标记物，如化学发光及荧光标记物，具有的灵敏度超过同位素标记物。应用这些非同位素标记物建立的免疫分析法有酶免分析法（enzyme immunoassay,EIA）、化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）及时间分辨荧光免疫分析法。酶免疫分析（EIA）是将酶催化放大作用和抗原与抗体免疫反应的特异性相结合的一种测定方法。根据测定过程中是否需要将结合的酶标记物和游离的标记物分离，而分为均相分析与非均相分析两类。①均相测定中由于免疫反应后有酶活性改变，不需将游离和结合的酶标记物分开。该方法操作步骤简单、快速，灵敏度为10－9mol/L，主要用于小分子半抗原测定，但因受样品中非特异干扰物影响，其灵敏度不如非均相EIA高。②非均相EIA分为竞争性和非竞争性两大类，竞争性非均相又分为酶标记抗原和酶标记抗体的EIA。酶标记抗原与抗原相互竞争有限抗体结合，洗去游离抗原和酶标记抗原，测定固体抗体结合的酶标记抗原的酶活性，即可测得被测物量。此法快速，非特异性结合低，但灵敏度不如RIA高。酶标抗体EIA是用酶标记抗体作为示踪剂，使标记抗体和未标记抗体竞争同固相抗原结合，固相抗原结合的酶标抗体同被测抗体的浓度成反比，测定固相抗原结合的酶标抗体的酶活性，即可定量测定被测抗体浓度，其灵敏度同RIA。
2．抗体过量分析
（1）酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：是非竞争性、非均相的酶免疫分析法或称夹心EIA，它是抗体过量分析法，其基本原理是使用两种抗体，一种作固定抗体，另一种作酶标抗体，被测抗原可同时与两种抗体结合，夹在两种抗体之间，这种双位点夹心原理明显提高了测定特异性和灵敏度，目前被广泛应用。
（2）免疫放射分析法（immunoradiometric assay,IRMA）:是应用双位点，非竞争性结合和过量抗体的免疫放射分析技术，其基本原理是选择一对各自与被测抗原分子上不同位点结合，彼此完全互不干扰的单抗，其中一种作为固相抗体，另一种抗体用放射性核素标记，作为被测抗原进行特异性定量指示剂，经过免疫反应，根据固相载体上抗体-抗原-标记抗体结合物的放射活性，可知被测物抗原的含量。这种方法特异好、灵敏度高、快速、简便，但不适于小肽和类固醇激素，因为小分子物质很难获得抗两个不同结合位点的单抗。
（3）荧光免疫分析（fluorescence immunoassay,FIA）是将荧光素标记在抗体或蛋白质抗原上作为示踪物，根据相应抗原或抗体结合原理，测定结合的或者游离的荧光强度，即可知被测抗体含量。由于荧光测定中受操作系统的本底荧光的干扰及激发光源散发光的影响，方法稳定性差，灵敏度也受限，进一步创建了以镧系元素螯合物作为示踪物的免疫测定方法称时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay,Tr-FIA）这种方法消除非特异本底荧光的干扰，提高方法特异性和灵敏度，且标记化合物稳定、方法简单、快速。
  （四）化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）
是将化学发光分析和免疫反应相结合的一种新型超微量分析技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫分析法（EIA）相似，不同之处是以发光物质代替同位素或酶作为标记物，或以发光试剂作为相应底物，并借助其发光强度直接进行测定。其测定方法可分为使用限量的特异性抗体进行竞争结合分析，也可应用过量的标记抗体做非竞争结合分析。发光反应系统中是以化学反应为基础的，该系统是由发光化合物、氧化剂、催化剂组成，不同发光体系的反应条件、发光强度和波长等均有差别，所以出现了许多种方法，如化学发光免疫测定法、化学发光酶免疫分析法、化学发光ELISA等，这些方法具有无污染、稳定、快速及超微量分析等优点，被广泛用于抗原、半抗原和抗体的检测。
免疫测定方法已广泛应用于各个领域，其中在妇产科用来测定雄激素（睾酮、双氢睾酮、脱氢异雄酮、雄烯二酮）、雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、雌四醇）、孕激素（孕酮、17-羟孕酮）、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、促黄体生成素、促卵泡生成素、性激素结合蛋白、生长激素抑制素、泌乳素等激素的测定。在妇科肿瘤疾病诊断中也广泛应用。
  （五）肿瘤标志物的检测方法
    肿瘤标志物（tumor marker）是肿瘤组织和细胞由于癌基因或抑癌基因和其他肿瘤相关基因及其产物异常表达所产生的抗原和生物活性物质，在正常组织和良性疾病时，几乎不产生或产量甚微，可在肿瘤患者组织、体液和排泄物中检出，它反映了癌的发生和发展过程及肿瘤相关基因的激活或失活程度。此外，在患者机体内，由于肿瘤组织侵润正常组织，引起机体免疫功能和代谢异常，产生一些生物活性物质和因子，虽然这些物质和因子特异性低，但与肿瘤的发生发展有关，也可用于肿瘤诊断，故也将其称为肿瘤标志物。肿瘤标志物可分为两大类，即由肿瘤组织产生及肿瘤与宿主相互作用而产生的两类肿瘤标志物。前者包括分化抗原（淋巴细胞表面标志物）、胚胎抗原、同功酶、激素、组织和器官特异抗原、癌基因和抑癌基因及其产物、癌基因病毒的整合DNA、糖蛋白或其他糖蛋白或糖脂、多胺及唾液酸等。另一类宿主反应标志物包括血清铁蛋白、免疫复合物、急性期蛋白、同功酶、白细胞介素-2受体、肿瘤坏死因子及新喋呤等。检测肿瘤标志物除一些血清酶可用测定活力的方法定量外，对无酶活力的蛋白类或其它肿瘤标志物大多需用免疫法测定。现有的肿瘤标志物主要用于辅助临床诊断、观察治疗反应、尽早发现肿瘤复发、转移及预后判断等。但目前还没有任何一种标志物是对肿瘤绝对特异的，因为某些良性病变也可出现不同程度阳性反应，所以，肿瘤标志物检测结果，必须结合临床分析，才能得到正确诊断。
三、 分子生物学的应用
传统的疾病诊断方法大致有三种即临床学诊断、血清学诊断及生化学诊断，这些方法都是以疾病的表型改变为依据的。在大多情况下表型改变出现的时间较晚，且不是很特异，使明确诊断有一定困难。因此，应用基因诊断，直接探查基因存在和缺陷，从而对人体状态和疾病作出诊断。按其原理分为三大类：DNA探针技术、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术和二者结合的技术。DNA探针技术包括Southern印迹杂交、检测DNA图谱、Northern印迹杂交主要检测mRNA而不是DNA、点杂交、液相杂交、夹心杂交、寡核苷酸探针技术及原位杂交。聚合酶链反应（PCR）技术包括：①PCR结合斑点杂交检测基因点突变。②PCR结合酶解DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLPs）作为遗传标志，进行缺陷基因的连锁分析和产前诊断。③多重PCR快速检出基因中的缺失及点突变。④PCR产物的直接测序。基因诊断是一种强有力的诊断方法，它已广泛应用于产前诊断，单基因病或多基因病诊断以及基因治疗遗传病都有很大进展。
四、生物芯片技术在医学中应用
    生物芯片（biochip或bioarray）是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。主要是通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相介质上，形成的生物分子点阵。在此类芯片的基础上，又发展出微流体芯片（microfluidics chip）或称微电子芯片（microelectronic chip）即为微缩实验芯片（lab-on-a-chip）。目前最常见的生物芯片是基因芯片（gene chip；又叫DNA chip，DNA microarray），其中基因表达谱芯片的应用最为广泛，这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平变化。为研究基因功能和基因遗传网络提供有力手段。表达谱芯片研究流程包括样本制备、荧光标记、杂交、芯片扫描、芯片图像处理和基因表达信息分析。基因芯片可以广泛用于基因分型、基因突变、基因表达谱、遗传作图、新基因寻找、重测序、疾病诊断及药物筛选。基因芯片（珠）技术可具有高通量、大规模、高灵敏度、高度自动化、快速高效等优点。基因芯片将人类和模式生物的生物学信息量进行集成化处理，使人类可以在分子水平探索健康和疾病的奥秘。
五、生物医学工程学的应用
   关于生物医学工程学的狭义定义是“应用工程学原理和方法来解决生物学和医学的问题”。 广义是：“生物工程学结合物理学、化学或数学和工程学原理，从事生物学、医学、行为学或卫生学的研究；提出基本概念、产生从分子水平到器官水平的知识，开发新的生物学制品、材料、加工方法、植入物、器械和信息学方法，用于疾病预防、诊断和治疗、病人康复、改善卫生状况等目的”。与生物医学工程学同时兴起的纳米生物技术也将成为21世纪最具有前途的科研领域。纳米（1/10亿米）结构通常是指尺寸在100纳米以下的微小结构，在这种水平上对物质和材料进行研究处理的技术称为纳米技术，也就是一种用单个原子、分子制造物质的科学技术，例如目前应用此技术制作医药抗菌产品，在人工器官外面涂上纳米粒子，就可以预防人工器官移植的排异反应。在医学检验学领域使用纳米技术的新型诊断仪器，应用少量血液，通过蛋白质或核酸诊断各种疾病，应用极细小的氧化铁纳米颗粒导入癌瘤里，引起高温破坏癌细胞，而不使周围健康组织受损伤等。各种有价值的应用，都将给人类的生活带来深远的影响。美国实验生理学会联合会认为：“分子医学将在2020年成为人类健康的基础。分子医学的实践将包括新的预防方法、新的诊断方法和新的治疗方法，新的治疗方法将直接针对造成疾病分子、细胞或生理缺陷。这些新医学方法的基础将是精确和无创的成像及诊断技术，它们将与直接的合理设计的分子和药物治疗方案一起联合使用。有关正常细胞与分子生理学和遗传学的深层理解，将成为其实践依据”。这些变化将对卫生保健模式带来很大变革，正在改变着医学研究前景。

                                                               （孙梅励）