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肿瘤坏死因子α基因多态性与多囊卵巢
综合征发病的关系
毛文伟 俞琳 陈咏健 张小为 李美芝
【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因多态性与多囊卵巢综合征(PCOS)发病的关系。方法 用聚合酶链反应、限制性内切酶消化及电泳技术，对118例PCOS患者和54例对照者TNF-α基因启动子区-308位碱基多态性进行检测。出现87/87片段定义为TNF1基因型，出现87/107和107/107片段定义为TNF2基因型。比较两种基因型在PCOS患者和对照者的分布及其与PCOS患者糖代谢特征的关系。结果 TNF1和TNF2基因型在PCOS患者分别为74.6%、25.4%，和对照者(68.5%和31.5%)的分布比较，差异无显著性(P>0.05)。PCOS患者中，肥胖者44例，非肥胖者74例；肥胖TNF1基因型患者胰岛素敏感性(指数为0.014±0.002)显著低于肥胖TNF2基因型患者(指数为0.051±0.034)（P<0.05），其他糖代谢指标在两者无显著差异；而非肥胖TNF1基因型患者和非肥胖TNF2基因型患者之间各指标都没有显著差异。肥胖TNF1基因型患者糖耐量各指标均与非肥胖TNF1基因型患者有显著差异（P<0.05）；而肥胖TNF2基因型患者与非肥胖TNF2基因型患者的空腹血糖和胰岛素、60 min血糖、葡萄糖曲线下面积以及胰岛素敏感指数在两者间差异无显著性（P>0.05）。结论 TNF-α基因-308位碱基多态性与PCOS无明显相关性，但TNF2基因型与肥胖PCOS患者糖耐量异常一定程度的改善有关。
【关键词】 多囊卵巢综合征； 肿瘤坏死因子； 多态现象(遗传学)
Study on the Relationship between a Polymorphism of Tumor Necrosis Factor-α Gene and the Pathogenesis of Polycystic Ovary Syndrome
MAO Wenwei,CHEN Yongjian, et al.
（Department of Obstetrics and Gynecology, Third School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100083, China）
YU Lin
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between -308 bp polymorphism in tumor necrosis factor-α (TNF-α) gene promoter region and the pathogenesis of polycystic ovary syndrome (PCOS). Methods One hundred eighteen Chinese women with PCOS (44 were obese,and 74 nonobese) and 54 controls were genotyped according to the fragment length ［87bp and(or) 107 bp］ of TNF-α gene promoter by the technique of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. The distribution of TNF1 genotype (87/87) and TNF2 genotype (87/107+107/107) in the two groups and their relations to parameters of glucose metabolism associated with PCOS were compared. Results There was no significant difference in the distribution of TNF1 and TNF2 genotypes between PCOS group and the controls (P>0.05). In obese PCOS group, only significant lower insulin sensitivity index was found in TNF-1 genotype as compared with TNF2 genotype (P<0.05).In nonobese PCOS group, there was no significant difference in all parameters of glucose metabolism between TNF1 and TNF2 genotype. All parameters of glucose metabolism in obese patients with TNF1 genotype were significantly different from those in nonobese with TNF1 genotype. However, significant differences were found only in some parameters when comparison was made between obese and nonobese within the TNF2 genotype group. Conclusion There is no association between TNF-α gene -308 bp polymorphism and the pathogenesis of polycystic ovary syndrome, but PCOS patients with TNF2 genotype may associate with improvement to certain degree on abnormal glucose tolerance usually existed in obese PCOS women.
【Key words】 Polycystic ovary syndrome； Tumor necrosis factor； Polymorphism(genetics)
多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的病因尚不清楚，其家族群聚现象提示遗传因素的作用［1］。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是有较广泛作用的细胞因子，参与卵泡发育调节［2］，与胰岛素抵抗和肥胖相关［3］。我们对TNF-α基因-308位碱基多态性［4］和PCOS的关系进行研究。
资料与方法
一、研究对象
1．PCOS组：为118例于1998年3月到1999年1月期间在我院妇科内分泌门诊诊断为PCOS的汉族女性，平均年龄（28.0±0.5）岁，其中肥胖患者（体重指数≥25 kg/m2）44例，平均体重指数（28.6±0.5）kg/m2；非肥胖患者（体重指数<25 kg/m2）74例，平均体重指数（21.5±0.3）kg/m2。诊断标准：（1）月经异常（稀发、量少、闭经、功能失调性子宫出血）；（2）近3个月未用激素并在月经第2～4天或闭经期（B超未见优势卵泡）的血黄体生成素/促卵泡激素≥2和（或）睾酮≥2.2 nmol/L和（或）雄烯二酮>9.0 nmol/L；（3）B超检查一侧或双侧卵巢卵泡数≥10个，直径2～8 mm；（4）排除高泌乳素血症、甲状腺疾病、柯兴综合征等其他雄激素增高性疾病。
2．对照组：54例健康汉族女性，选自同期北京医科大学教职员工，平均年龄（31.1±1.1）岁，月经规律，无多毛、痤疮或脂溢性皮肤。其中肥胖8例，平均体重指数（25.5±0.1）kg/m2；非肥胖46例，平均体重指数（21.0±0.2）kg/m2。
二、方法
1．DNA提取［5］：两组均取外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝,常规抽提基因组DNA。
2．TNF-α基因多态性片段的扩增［5］：位于6号染色体的TNF-α基因启动子区-308位碱基鸟苷酸突变为腺苷酸，使原来限制性内切酶Nco I特异识别的切割位点消失，从而在人群中产生基因多态性。扩增含该多态位点片段的正反引物序列分别为5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′和5′-TCCTCCCTG CTCCGATTCCG-3′（西班牙Cristina Gutierrez教授惠赠）。聚合酶链反应(PCR)体系（25 μl）：基因组DNA 50～100 ng，引物0.2 μmol/L, 4种脱氧核糖核酸混合物200 μmol/L，盐酸三羟甲基氨基甲烷(pH值8.3) 10 mmol/L，氯化钾50 mmol/L，氯化镁1.5 mmol/L，0.01%明胶，Taq酶1 U，三蒸水补至终体积。反应在水浴式PCR热循环仪（中国科学院遗传研究所产品）上进行：先在94℃预变性5 min，然后94℃变性40 s、56℃退火40 s、72℃延伸 40 s，共循环35次。扩增片段长度为107 bp。
3．TNF-α基因多态性检测［5］：酶切反应体系（10 μl） 为PCR扩增产物5 μl，限制性内切酶Nco I 3 U，醋酸钾50 mmol/L，醋酸三羟甲基氨基甲烷(pH值7.9) 20 mmol/L，醋酸镁10 mmol/L， 二硫苏糖醇1 mmol/L，三蒸水补至终体积。酶切体系在37℃水浴消化6 h至过夜。若鸟苷酸突变为腺苷酸，则限制性内切酶Nco I特异切割位点消失，片段仍为107 bp；若没有突变，则因存在酶切位点而产生87 bp和20 bp两种片段。因而在人群中有2种等位基因，分别以107和87表示；形成3种基因型，分别以107/107、107/87和87/87表示（图1）。将87/87基因型定为TNF1，而含有鸟苷酸到腺苷酸改变的87/107和107/107基因型定为TNF2。消化片段经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、0.2%硝酸银染色［6］后在凝胶上呈深棕色条带，读取基因型并摄相保存。
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1和10：Marker；2、4和6：87/87基因型；
3、5、7和9： 87/107 基因型；8：107/107基因型
图1 TNF-α基因-308位碱基多态性观察
4．PCOS患者糖耐量和胰岛素释放试验：清晨空腹抽血后服葡萄糖75 g，并于服糖后1 h、2 h分别再抽血。葡萄糖氧化酶法测定血糖，用125I-胰岛素放射免疫试剂盒（中国原子能科学研究院产品）测定血清胰岛素。
胰岛素敏感性指数=1/（空腹血糖值
×空腹胰岛素值）［7］
葡萄糖和胰岛素曲线下面积均=0.25×0 h值
+0.75×1 h值+0.5×2 h值［8］
三、统计学方法
采用χ2检验和t检验，均在SPSS统计软件包内进行。
结果
一、TNF-α基因-308位碱基多态性分布情况
PCOS组中，TNF1基因型占74.6%（88/118），TNF2基因型占25.4%（30/118）；对照组中，则分别占68.5%（37/54）和31.5%（17/54）。两组比较，差异无显著性（P>0.05）。87/87、87/107和107/107基因型在PCOS组、对照组以及总体中分布的观察值与期望值相比，差异无显著性(P>0.05)。见表1。
表1 各组患者TNF-α基因-308位碱基多态性的分布情况 |
| 组别 |
总例数 |
87/87基因型 |
|
87/107基因型 |
|
107/107基因型 |
Hardy-Weinberg平衡检验
P值 |
| 例数 |
百分率(%) |
例数 |
百分率(%) |
例数 |
百分率(%) |
| PCOS组 |
118 |
88 |
74.6 |
|
29 |
24.6 |
|
1 |
0.8 |
0.705 |
| 对照组 |
54 |
37 |
68.5 |
|
13 |
24.1 |
|
4 |
7.4 |
0.234 |
| 合计 |
172 |
125 |
72.7 |
|
42 |
24.4 |
|
5 |
2.9 |
0.821 |
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二、不同基因型PCOS患者的葡萄糖代谢特征
肥胖TNF1基因型患者的胰岛素敏感性显著低于肥胖TNF2基因型患者（P<0.05），其他糖代谢指标在两者间差异无显著性(P>0.05)；而非肥胖TNF1基因型患者和非肥胖TNF2基因型患者之间各指标均无显著差异。肥胖TNF1基因型患者糖代谢各指标均与非肥胖TNF1基因型患者有显著差异（P<0.05）；而肥胖TNF2基因型患者的这些指标并不都与非肥胖TNF2基因型患者有显著差异，空腹血糖和胰岛素、60 min血糖、葡萄糖曲线下面积以及胰岛素敏感指数在两者之间无显著差异。见表2。
讨论
一、TNF-α基因-308位碱基多态性与PCOS的关系
TNF-α是具有多向性作用的细胞因子，功能涉及细胞增殖和凋亡等［3］。近年研究发现，（1）TNF-α能抑制细胞膜上胰岛素受体β链和受体底物-1酪氨酸激酶磷酸化，使胰岛素信号转导受损，形成胰岛素抵抗［3］；（2）TNF-α可能通过影响膜内cAMP水平调节卵泡雌激素分泌和卵泡发育［2,9］；（3）TNF-α基因-308位启动子区碱基鸟苷酸突变为腺苷酸，在体外载体细胞中可导致TNF-α基因mRNA表达水平改变，可能对细胞胰岛素敏感性有影响［4］。由于早先研究提示6号染色体短臂可能存在PCOS易感基因［10］，因此推测TNF-α基因-308碱基多态性可能与PCOS发生有关。
但本研究结果显示，TNF1和TNF2基因型在PCOS组的分布与对照组没有显著差异；87/87、87/107和107/107基因型在PCOS组和对照组中的分布符合Hardy-Weinberg基因平衡定律，同样说明两组差异无显著性。它们在总体中的频率分别为72.7%、24.4%和2.9%，可反映汉族群体在该位点的多态情况，与白种人群相似［4］。
二、TNF-α基因-308位碱基多态性对PCOS患者胰岛素敏感性的影响
TNF1基因型肥胖PCOS患者胰岛素敏感性显著低于TNF2基因型肥胖PCOS患者，提示TNF2基因型PCOS患者能一定程度地抵抗肥胖导致的胰岛素敏感性下降。这一特性在肥胖和非肥胖PCOS患者间尤为明显，肥胖TNF1基因型患者的所有糖代谢指标均与非肥胖TNF1基因型患者有显著差异；而在肥胖和非肥胖TNF2基因型患者间不全如此，即空腹血糖和胰岛素、60 min血糖、葡萄糖曲线下面积、胰岛素敏感性指数在两者之间无显著差异。这一现象说明,TNF1基因型的肥胖PCOS患者，如果存在胰岛素抵抗，会比TNF2基因型的肥胖患者表现更重。这种基因对表型的修饰作用可能是PCOS临床表现多样性的原因之一。
表2 TNF1和TNF2基因型PCOS患者口服葡萄糖耐量试验反应的比较( ±s) |
| 类别 |
例
数 |
BMI
(kg/m2) |
葡萄糖(mmol/L) |
胰岛素（IU/L） |
胰岛素
敏感性指数 |
| 0 min |
60 min |
120 min |
曲线下面积 |
0 min |
60 min |
120 min |
曲线下面积 |
| 肥胖PCOS |
| TNF1基因型 |
33 |
28.7±3.3 |
5.6±0.5* |
9.1±0.7* |
7.8±0.7* |
12.0±0.9* |
23.0
±3.4* |
132.3
±12.5* |
103.2
±11.3* |
156.7
±12.6* |
0．014
±0.002* |
| TNF2基因型 |
11 |
28.4±2.5 |
4.9±0.2 |
7.6±0.7 |
6.5±0.4** |
10.2±0.7 |
18.6
±9.4 |
147.1
±22.3** |
136.3
±16.9** |
183.1
±25.1** |
0.051
±0.034*** |
| 非肥胖PCOS |
| TNF1基因型 |
55 |
21.5±2.1 |
4.7±0.1 |
7.1±0.3 |
6.1±0.2 |
9.6±0.3 |
8.1
±0.4 |
72.8
±5.2 |
67.8
±7.2 |
90.5
±6.9 |
0.030
±0.002 |
| TNF2基因型 |
19 |
21.4±2.3 |
4.8±0.1 |
7.1±0.5 |
5.4±0.2 |
9.2±0.4 |
8.2
±1.5 |
78.8
±14.5 |
37.3
±10.4 |
79.8
±13.2 |
0.031
±0.004 |
| * 与非肥胖TNF1基因型PCOS患者相比， ** 与非肥胖TNF2基因型PCOS患者相比， ***与肥胖TNF1基因型PCOS患者相比，P均<0.05
需要一提的是，在白种正常肥胖人中，TNF2基因型的胰岛素敏感性低于TNF1基因型［4］，与我们的结果正好相反。这可能是人种差异，也可能是PCOS患者体内特殊的内分泌环境引起的TNF-α生物学行为改变［3］。
总之，本研究未发现TNF-α基因-308位碱基多态性与PCOS的相关性，但TNF2基因型与肥胖PCOS患者糖耐量异常一定程度的改善有关，其机理有待深入研究。
(本文编辑：姜民慧)
毛文伟（100083 北京医科大学第三医院妇产科）
俞琳（浙江省杭州市第一医院妇产科）
陈咏健（100083 北京医科大学第三医院妇产科）
张小为（100083 北京医科大学第三医院妇产科）
李美芝（100083 北京医科大学第三医院妇产科）
参考文献
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(收稿日期：1999-12-28) | |
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