树突状细胞与肿瘤免疫治疗

     树突状细胞（Dendritic cells, DC）是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞（APC），参与抗原的识别、加工处理与提呈，是机体免疫反应的首要环节，也是免疫反应中识别自我与非我的关键环节。近年来国际上对DC的研究进展很快，对于DC在肿瘤免疫、感染免疫、移植免疫、自身免疫等方面作用的认识不断深入。
     目前认为，肿瘤的特异性免疫应答主要是由T细胞应答来承担的。肿瘤免疫逃逸的机制可能有以下几个方面。1. 由于机体正常细胞也存在肿瘤相关抗原（TAA），使得免疫系统忽略了肿瘤细胞的存在。2. 在选择压力下，肿瘤抗原发生变异，甚至消失。3. 肿瘤抗原表达量下调。4. 肿瘤释放TGF-β或IL-10等免疫抑制因子。 5. 肿瘤细胞表面缺乏共刺激分子，以及MHC I类分子的减少，都可能导致肿瘤的免疫原性减弱。6. 肿瘤细胞表达的FasL与T细胞表面的Fas相结合，将导致T细胞凋亡[1]。因而，肿瘤抗原不能有效提呈给T细胞是肿瘤免疫逃逸的重要原因。
     20世纪90年代以来，随着对DC扩增方法的研究，，已经可以在体外获得可观数量的DC[2-5]，这为以DC为基础的肿瘤疫苗的研究提供了可能。多项研究及临床试验表明，负载有肿瘤抗原的DC能够有效的活化T细胞，从而杀伤肿瘤细胞，进一步减少肿瘤负荷。继非特异性免疫原（如BCG）及细胞因子（如IL-2和干扰素）用于肿瘤免疫治疗后，DC已成为肿瘤免疫治疗的新手段。本文将对DC的生物学特性，获得DC的方法，将肿瘤抗原负载于DC的途径，以及DC肿瘤免疫治疗的临床应用概况进行论述。
一．树突状细胞
     DC是目前已知功能最强的APC，是免疫反应的始动者和调节者。早在1868年，人们就发现了皮肤中的朗格罕细胞（Langerhans cells），但是直到20世纪70年代，Steinman和Cohn才首次报道了DC。DC因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。目前认为，具有典型的树突状形态、高表达MHC II类分子、具有一些相对特异性表面标志，并能够刺激初始型T细胞（Naive T cells）增殖活化的细胞，才能称为DC。
     体内DC主要分为髓系DC（Myeloid-lineage DC）和淋巴系DC（Lympoid-lineage DC）两大类，它们来源于各自的前体细胞。髓系DC包括血液DC、朗格罕细胞、隐蔽细胞、生发中心DC等。它们与单核、粒细胞有共同的祖细胞，能够分化为巨噬细胞。淋巴系DC包括胸腺内DC等。它们与T细胞、NK细胞有共同的前体细胞，能分化为淋巴细胞。目前对淋巴系DC的分化发育过程仍了解不多。
     随着对DC研究的深入，研究者对DC进行了亚群分类，但是尚未形成统一的亚群区分标准。在小鼠DC的研究中，对CD8a+DC和CD8a-DC 的分类和功能研究较多。 人外周血DC常被分为三个亚群 （亚群1为CD1a+ CD11c+，亚群2为CD1a-CD11c+，亚群3为CD1a-CD11c－），它们在形态、表型、抗原摄取能力、细胞因子依赖性等方面有所不同。近来有学者提出了I型和II型DC的概念，I型DC促使Th0向Th1分化，通过IFN-γ、IL-2的分泌介导Th1细胞免疫反应；II型DC促使Th0向Th2分化，通过IL-4、IL-10的分泌介导Th2细胞免疫反应[6]。
     对于DC的分化发育过程，目前已知DC的前体细胞由骨髓进入血液，随循环流至非淋巴组织，发育为非成熟DC。这时的DC表达低水平的共刺激分子和粘附分子，在体外激发MLR的能力较弱，但是具有很强的抗原捕获和加工能力，通过巨胞饮、受体介导的内吞及吞噬等方式摄入外源性抗原，加工后与MHC II类分子结合为复合物提呈于DC表面。通过巨胞饮及吞噬摄入的外源性抗原也可通过MHC I类途径提呈。在炎症介导因子（如LPS、TNFα）和“危险信号”的作用下，DC迁移至次级淋巴器官并成熟。成熟DC的表面MHC II类分子、共刺激分子和粘附分子的表达显著提高，体外激发MLR的能力很强，但失去了大部分摄取加工抗原的能力。成熟的DC能够吸引、活化幼稚T细胞并与之相互作用，从而启动初级免疫反应。近来发现了交叉提呈（cross-priming），外源性抗原可以以凋亡小体的形式被DC摄取，通过MHC I类分子呈递。
　　　与其他APC相比，DC具有更强的抗原提呈作用和T细胞活化作用，并且是已知的唯一可以激活初始型T细胞的APC。DC表面的MHC和MHC-肽复合物量是其他APC的10~100倍。在MLR中，通常刺激细胞与效应细胞是等量混合的，而DC的一个细胞就可以活化100~  3,000个T细胞[7]。在体内，DC对CD4+ T 细胞的活化作用是B细胞的1,000倍，是巨噬细胞的100余倍[8]。成熟DC在激活T细胞的同时，CD4+ T细胞的CD40L与DC上的CD40结合，又可以使B7分子进一步上调，并分泌高水平的IL-12，从而主导Th1型应答。此外，DC还可以促进B细胞在滤泡外区域的生长与分化，使B细胞大量分泌免疫球蛋白。可见，DC在免疫反应中，特别是起始阶段，具有重要的作用。
　　　
二．DC体外扩增的方法
     DC分布广泛，但是数量极少，仅占外周血单个核细胞（PBMC）的1%以下，占小鼠脾脏的0.2%到0.5%[9]。在很长时间内，细胞来源困难成了限制对DC研究的主要原因。1992年，Steinman实验室最先建立了使用GM-CSF从小鼠骨髓中大量制备DC的方法，以后，又逐渐建立和改良了从人外周血中诱导扩增DC的方法，使对DC的研究和应用成为可能[2-5]。
     小鼠骨髓细胞仅需加入GM-CSF就可以在体外大量生成DC，加入IL-4可以抑制巨噬细胞的生成而促进DC生成。由于小鼠骨髓易获取，这种方法获得的DC量又相对较多，因而已经成为实验小鼠模型中常用的方法。近来又发现，在GM-CSF和IL-4的作用下，小鼠的单核细胞也可以分化为DC，并被证明在CTL介导的免疫反应中是有效的[10]。此外，使用GM-CSF或Flt3配体可以在小鼠体内获得大量的DC[11]。
     同时，对于如何从人外周血中获得DC也进行了大量的研究。概括起来，可以从以下四种前体细胞出发获得DC[12]：CD34+细胞、去除CD34+细胞的外周血单个核细胞、CD14+细胞以及PBMC。后三者可能含有共同的能够发育为DC的细胞。向CD34+细胞培养体系中加入GM-CSF和TNFα可以获得典型的朗格罕细胞。而去除CD34+细胞的外周血单个核细胞、CD14+细胞以及PBMC在加入GM-CSF及IL-4后能够分化为DC。无论DC或其前体细胞在这样的培养条件下都不能增殖,也就是说，所获得的DC数量不可能超过开始的单核细胞数[13]。
     为了临床研究使用的需要，对DC培养条件上进行了探索，特别是使用了自体血浆或无血清培养基，以避免异体抗原可能带来的不利反应。但是有报道使用自体血清或血浆后，DC的产量明显减少[10]。此外，考虑到无血清培养体系获得的DC不稳定，在去掉GM-CSF和IL-4、输注到病人体内后将逆转为单核细胞，又使用了单核细胞-条件培养基（monocyte-conditioned medium）[3,4], TNFα或CD40配体[14,15]促进DC成熟。应用Flt3配体体内扩增DC获得成功也有报道[16]。
     目前尚无能够用于DC鉴定的特异性分子标志。在鉴定所得到的细胞是否为DC时，常常要通过形态、组合性细胞表面标志、MLR中刺激初始型T细胞增殖等几方面综合判断。DC相对特异性标志目前应用的有：小鼠DC的33D1和NLDC145，大鼠DC的OX62，人DC的CD1a和CD83。如果能够发现新的特异性分子标志，人们对于DC的认识必将大大深入。
三．DC负载肿瘤抗原的途径
     由于DC具有显著的抗原提呈作用，人们开始通过各种途径将肿瘤抗原负载于DC。但是，究竟应当负载已知的还是未识别的肿瘤抗原呢？使用已知抗原（如CEA、HER-2/neu等）能够减少引起那些不需要的免疫反应的可能性，并且可以制备大量高纯度的抗原以备临床研究使用。但是，目前已知的肿瘤抗原有限，这种方法不能广泛应用；其次，还必须确定所应用的肿瘤抗原是否能引起最有效的免疫反应。Anichini从一些黑色素瘤病人体内分离到的肿瘤特异性T细胞大部分都不能识别已知的黑色素瘤抗原[17]，说明这些病人体内能够引起有效肿瘤免疫的抗原还未被识别。而尚未识别的肿瘤抗原来自病人的肿瘤组织，因而可能有着最强的免疫原性，对于发生了抗原丢失变异的情况也是有效的。但是这要求有相当数量的肿瘤组织以获取抗原。而且，由于这类抗原可能存在于正常组织，所以有引起自身免疫反应的潜在危险。
     对于如何将肿瘤相关抗原（TAA）负载于DC，人们做了多种尝试。用抗原肽体外冲击致敏DC，然后回输或免疫接种至荷瘤宿主，能够显著的诱导产生抗原特异性CTL，产生保护免疫。它在技术上操作简便，无论是已知的抗原肽还是尚未识别抗原的肿瘤提取液都可以应用 [18-21]。以蛋白质形式负载于DC的抗原要求有大量的肿瘤组织并经过高度的纯化[22]，有效性因此减低。尚未识别的抗原还可以通过肿瘤裂解物的形式负载于DC[23]，或将肿瘤与DC融合[24, 25]。此外，由于MHC限制性抗原多肽半衰期短，用肿瘤抗原多肽体外冲击致敏DC需要反复输注DC，人们想到了将编码TAA的DNA导入 DC，证实能有效的呈递抗原[26, 27]，并使DC持续表达TAA。在众多基因转移方式中，以腺病毒介导的基因转染最有效，其转染效率可达90%以上。另外，Boczkowski等人将肿瘤细胞的RNA分离并负载于DC[28]，也成功诱导了抗肿瘤免疫。使用mRNA的优点是仅需少量的肿瘤组织，而且肿瘤遗传物质没有整合到DC基因组的危险[29]，但是理论上它也具有引起自身免疫反应的可能。除此之外，Celluzzi和Falo观察到将DC与肿瘤细胞共培养24小时后二者发生密切联系，同样可有效的诱导免疫反应[30]。更为特殊的是，法国与意大利的合作小组发现DC分泌一种叫exosome或dexosome的小体，可以提呈抗原并诱导强烈的CTL反应。负载TAA的DC上清里就含有exosome，这些exosome表达MHC I类和II类分子及CD86，这提供了一种以DC为基础的，新型的亚细胞成分的瘤苗[31,32]。

四．DC用于肿瘤临床治疗概况
     1996年，Hsu和他的同事们首次报道了负载肿瘤抗原的DC能够诱导肿瘤特异性T细胞并取得临床疗效的试验[33]。他们用非霍奇金B淋巴瘤表达的独特型免疫球蛋白或匙孔蛎血蓝素(KLH)负载于DC，而后静脉输注。所选择的4个病人都是低级别的淋巴瘤患者，对化疗耐药。所有的病人都发生了强烈的体液和细胞免疫反应，其中一人在4次注射后心包及主动脉周围的肿瘤完全消退，并维持了42个月[34]。此后该项试验一直被用于化疗后仍有微小残存病灶的病人。
     对于前列腺癌的DC治疗，Murphy小组报道了他们所观察的I期临床试验结果[35]。他们选择了前列腺特异性膜抗原（PSMA）的HLA-A0201特异性抗原多肽体外冲击外周血来源的自体DC，然后输注给病人。临床和免疫监测表明，相对于只使用DC或PMSA的病人组，使用了抗原肽负载DC的病人对PMSA的T细胞反应明显增强。观察到的副反应仅为轻到中度低血压和乏力。而后，该小组又对激素不应的前列腺癌转移病人进行了II期临床试验[36]，每6周回输一次PMSA负载的DC，25个病人中有8人出现了抗肿瘤免疫反应。
     在黑色素瘤方面，已知的黑色素瘤相关抗原有gp100、MART-1、MAGE-1、MAGE-3等。Nestle小组将自体肿瘤裂解物或MHC I类分子结合的已知黑色素瘤抗原多肽负载到DC上，在超声引导下将1~3?106个DC直接注入未转移的淋巴结，每1- 4周一次，共6~10次。16个病人中有11人出现了皮肤的延迟型超敏反应（DTH），5个病人肿瘤缓解，其中2人完全缓解并持续了15个月[37]。在此项研究中没有观察到明显的毒副作用，虽然有4例病人检测到了抗TSH受体和抗核抗体，但是对甲状腺的功能没有影响。
     在多发性骨髓瘤方面，大量的研究表明，宿主T细胞可以识别骨髓瘤蛋白的独特型决定簇。1995年，人们开始将独特型M蛋白负载的DC用于多发性骨髓瘤的病人[38]。病人在接受了大剂量马法兰(melphalan)化疗、全身放疗和外周血干细胞移植的一个月后，每月进行一次静脉注射负载M蛋白的DC，两个月后，再接受皮下免疫佐剂注射。结果，只有那些在注射前就已经达到完全缓解的病人才出现了所期待的免疫反应。其中一个病人出现了特异性T细胞增殖和杀伤反应。此外，将DC过继回输的临床试验还被用在乳腺癌、结肠癌、肾细胞癌[39]等肿瘤的治疗上。
     尽管目前以DC为基础的肿瘤疫苗临床试验取得了令人鼓舞的结果，仍然需要更多的研究来证实它的效果。同时，这一治疗途径还存在着诸多问题，例如使用的途径、剂量、注射的频率、使用哪一种DC亚型更好，等等。另外，由于大多数接受临床研究的病人都已经处于肿瘤进展期，通过DC治疗不一定能取得临床可见的反应, 必须找到敏感、简便、可靠的免疫监测技术来检测疫苗的有效性。目前，酶联免疫斑点试验（ELISPOT）[40,41]和双特异性抗体介导细胞因子获取试验[42]最有希望成为检测外周血抗原特异性CTL出现率的方法。
五. 结论
     DC作为功能最强的抗原提呈细胞，为肿瘤的免疫治疗提供了新的方向。以DC为基础的肿瘤疫苗是目前刺激抗原特异性细胞免疫反应的最有效的方法, 可以用于手术或放疗、化疗后仍有残存微小病灶的病人。现有的I期临床试验表明它能被很好的耐受，并能在体内介导产生免疫反应，II期临床试验也开始说明它的有效性。但是，围绕着以DC为基础的肿瘤疫苗的研究仍然有许多需要解决的问题。例如，目前将肿瘤相关抗原负载于DC的方法很多，但是基本上处于动物实验阶段，而临床试验大多采用的是将已知的TAA负载于外周血DC的方法，这限制了以DC为基础的肿瘤疫苗的应用范围。而其他方法用于人体是否安全有效，仍有待进一步的研究证实。当然，随着肿瘤免疫学研究的深入，随着对肿瘤抗原认识的增多，以DC为基础的肿瘤免疫治疗也必将取得更多的突破。

                                                         (周希亚  沈 铿)