基质金属蛋白酶及其组织抑制物预测葡萄胎恶变的研究

李志英　向阳　戴理　程国钧　张德永　杨秀玉　宋鸿钊

　　【摘要】　目的　探讨基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2)及其组织抑制物(TIMP-1、TIMP-2)表达量与葡萄胎恶变的相关性。方法　提取组织总RNA，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测22例正常早期妊娠绒毛及37例葡萄胎组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2基因表达量。结果　MMP-9、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2在葡萄胎组织及正常绒毛组织中的表达量差异无显著性(P>0.05)。但MMP-9/TIMP-1比值在发生恶变的葡萄胎组织明显高于未发生恶变的葡萄胎组织及正常绒毛组织(P<0.01);而MMP-2/TIMP-2在各组织中则无明显差异。结论　MMP-9/TIMP-1与葡萄胎恶变有关；MMP-9与TIMP-1表达量之比值可作为葡萄胎恶变的一项预测指标。
　　【关键词】　金属蛋白酶类； 金属蛋白酶类组织抑制剂； 葡萄胎

Prediction of Malignant Transformation of Hydatidiform Mole by mRNA Determination of Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitor of Metalloproteinases

LI Zhiying
（Department of Obstetrics and Gynecology, Hubei Sanxia Medical College, Hubei Province 443007, China）
XIANG Yang, DAI Li, et al.

　　【Abstract】　Objective　To investigate the relationship between the messenger RNA(mRNA) levels of matrix metalloproteinases(MMP-9, MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-1,TIMP-2) and malignant transformation of hydatidiform mole. Methods　Total RNA were isolated from tissues of 22 normal chorionic villi samples and 37 cases of hydatidiform mole. The mRNA expression of MMP-9, MMP-2,TIMP-1, TIMP-2 genes were determined by RT-PCR. Results　The differences of the mRNA expression of MMP-9, MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 genes in the tissues of hydatidiform mole and normal preganacy villus were not significant (P>0.05). The ratio of MMP-9/TIMP-1 in molar tissues with malignant transformation was higher than those in molar tissues without malignant transformation and in normal villus. Conclusion　It is a correlative relation beween MMP-9/TIMP-1 and malignancy of hydatidiform mole. The ratio of MMP-9/TIMP-1 might be used as an index for prediction of malignant transformation of hydatidiform mole.
　　【Key words】　Metalloproteinases; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Hydatidiform mole

　　葡萄胎是胚胎外层的滋养细胞发生变性、绒毛水肿而形成的水泡状物，具有生长活跃及潜在恶性的特点，其中约20%将发展为侵蚀性葡萄胎或绒癌，这一恶变过程的前提是滋养细胞必须多次溶解血管内皮基底膜^［1］。近年的研究发现，基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinase, MMPs)能降解基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原，促进肿瘤转移，而金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)与相应的MMPs酶原及其活化形式结合，从而抑制MMP的活性及产生，是肿瘤发生恶变与转移的阻抑基因，TIMP-1与MMP-9结合，TIMP-2与MMP-2结合。大量研究表明，MMP-TIMP调节失衡在肿瘤恶变与转移过程中起决定性作用，而在滋养细胞肿瘤中的研究尚未见报道。本研究通过检测正常早期妊娠绒毛及葡萄胎组织MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达，以探讨MMP/TIMP在葡萄胎恶变中的预测价值，为临床是否选择预防性化学治疗提供依据。

材料与方法

　　一、对象
　　1.正常绒毛组：取自北京协和医院计划生育门诊1998年12月人工流产患者(<12孕周)，共22例，年龄22～42岁，平均(27±11)岁。均无异常妊娠疾病史。
　　2.葡萄胎组：所有病例均为北京协和医院1995年10月至1999年6月住院的葡萄胎患者，均经病理学检查确诊为葡萄胎，并有完整的临床病理资料，共37例。患者年龄20～53岁，平均(31±10)岁。37例患者中，有17例发生了恶性变，其诊断标准参照宋鸿钊^［2］提出的侵蚀性葡萄胎诊断标准。17例葡萄胎清除前绒毛膜促性腺激素(hCG)>10⁶ IU/L者7例(占41.2%)。20例未发生恶变者术前hCG>10⁶ IU/L者4例(占20.0%)。
　　二、方法
　　1.组织标本收集及处理：全部标本均在手术时收集，取所需组织约0.2 g左右，0.9%生理盐水洗净血液，立即置入液氮备用。
　　2.组织总RNA的提取：用1 ml TRIZOL溶液(上海生物工程公司产品)将约0.1 g组织标本充分匀浆，加0.2 ml氯仿抽提蛋白，转移上清液，加0.5 ml异戊醇沉淀RNA，75%乙醇洗两次，溶于100 μl二乙基焦磷酰胺液中。用分光光度计鉴定RNA样品。
　　3.逆转录(reverse transcription, RT):模板RNA约为1 μg，加入0.5 μg/μl寡聚胸腺嘧啶核苷酸［Oligo(dT)₁₅］0.5 μl；40U/μl RNA酶抑制剂(RNAsin)0.5 μl(上海华美生物制品公司产品)；5×RT缓冲液4 μl；0.1 mol/L二硫苏糖醇1 μl；200U/μl AMV逆转录酶1 μl(美国GIBCO公司产品)；3.2 μl dNTP(2.5 mmol/L)；加DEPC水至终体积为20 μl。反应条件：68℃ 5 min、置于冰水混合物5 min、42℃ 60 min、95℃ 2 min。逆转录产物置于4℃保存。
　　4.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：所有引物均为北京赛百盛生物工程公司合成，以β-actin为内参照，用PCR扩增各目的基因。反应体系为25 μl：模板cDNA(RT产物)1 μl；10×PCR缓冲液2.5 μl(500 mmol/L Tris.HCl pH 8.2, 15 mmol/L MgCl₂, 500 mmol/L KCl)；dNTP 0.4 μl(终浓度400 μmol/L)；各引物均为1 μl(终浓度0.6 μmol/L)；Taq DNA聚合酶1U(美国GIBCO公司产品)；加去离子水至总体积为25 μl。起始变性95℃ 5 min，然后执行如下反应条件：94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。
　　5.PCR产物电泳及定量分析：取PCR产物5 μl，加6×上样缓冲液1 μl，2%琼脂糖凝胶(美国Promega公司产品)电泳(50V)60 min，其中TIMP-2引物扩增产物需3%琼脂糖凝胶电泳(50V)180 min。置于紫外透射成像系统(美国Bio-Rad公司产品)观察，电脑摄像储存，Molecular Analyst软件扫描分析，计算目的基因RT-PCR产物吸光度容积与β-actin基因RT-PCR产物吸光度容积之比值，作为目的基因mRNA的相对含量。
　　6.统计学分析：结果以±s表示，两组间均数采用t检验，两组间率采用精确概率法。

结果

图1　RT-PCR扩增MMP-9基因的结果

2为MMP-2，5、6、7和8为葡萄胎组织　　

2为TIMP-1

2为TIMP-2

图4　RT-PCR扩增TIMP-2基因的结果　　

讨论

　　正常妊娠的维持是胚胎与母体之间协同作用极其复杂的过程，正常早孕绒毛滋养细胞也具有类似于恶性肿瘤细胞的特点，能大量分泌MMP-2和MMP-9，从而选择性水解子宫内膜基质成分及一系列基底膜；而蜕膜细胞可同时产生转移生长因子β(TGFβ)，从而诱导滋养层及蜕膜细胞产生TIMPs，抑制MMPs的产生，使得MMP-TIMP维持一定范围的动态平衡，使绒毛滋养细胞侵及母体受到一定限制^［3］。
　　葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌是发生在生育期妇女常见的滋养细胞肿瘤。几乎所有的侵蚀性葡萄胎和50%的绒癌都是由葡萄胎恶变而来。目前，对葡萄胎恶变的预测主要是根据临床特点，如年龄、hCG值、子宫大小和病理检查等。但由于准确性不高，因而影响到对预防性化疗的评价。研究表明，滋养细胞肿瘤具有很强的亲血管性生物学特点，易于经血运转移。葡萄胎转变为侵蚀性葡萄胎，进而转变为绒癌的过程中，必须多次溶解血管内皮基底膜。故MMPs、TIMPs可能从分子水平客观地评价葡萄胎恶变的可能性。
　　本研究结果显示，在葡萄胎组织与早孕正常绒毛组织中，MMPs、TIMPs mRNA表达的单项检测在定性与定量方面无明显差异。其可能原因为葡萄胎变性滋养细胞在很大程度上与早孕绒毛滋养细胞具有相似的特点，对子宫内膜基质成分和基底膜的侵蚀程度具有相似性。从而其分泌的MMPs、TIMPs可能无明显差异。但由于葡萄胎滋养细胞变性增生，具有潜在恶性的特点，通过本研究发现，MMPs、TIMPs mRNA表达量的差异可导致MMP-TIMP的比值失衡。研究结果表明，MMP-9 mRNA表达量在发生恶变的葡萄胎组织略高于未发生恶变的葡萄胎组织及正常绒毛组织，但差异无显著性。而TIMP-1在发生恶变的葡萄胎组织，则有所降低，这样使得MMP-9相对增加，导致MMP-9与TIMP-1失去平衡，MMP-9相对TIMP-1为表达过量。而MMP-2、TIMP-2在各组织 中则无明显变化。MMP-9是相对分子质量为95 000 的蛋白明胶酶，主要由滋养细胞、癌细胞、巨噬细胞等分泌，其作用底物主要为Ⅳ型胶原^［4］。而

(本文编辑：赵小丽)

本课题受卫生部科研基金资助(基金编号：98-1-038)
李志英（湖北三峡学院医学院妇产科）
向阳（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）
戴理（基础医学研究所遗传室）
程国钧（解放军总医院妇产科）
张德永（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）
杨秀玉（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）
宋鸿钊（100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）

参考文献

1，向阳，杨秀玉. 妊娠滋养细胞疾病的诊治进展. 中华妇产科杂志，1998，33：441-443.
2，宋鸿钊. 滋养细胞肿瘤的诊断和治疗. 北京：人民卫生出版社，1981. 124-129.
3，Lala PK, Graham CH. Mechanisms of trophblast invasiveness and their control: the role of proteases and protease inhibitors. Cancer Metastasis Rev, 1990, 9: 369-379.
4，Ray JM, Stetler-stevenson WG. The role of matrix metalloproteases and their inhibitor in tumour invasion, metastasis and angiogenecsis. Eur Respir, 1994, 7: 2062-2072.
5，Fernandez PL, Merino MJ, Nogales FF, et al. Immunohistochemical profile of basement membrane proteins and 72 kilodalton type Ⅳ collagenase in the implantation placental site. Lab invest, 1992, 66: 572-579.