抗苗勒管激素作为卵巢颗粒细胞瘤肿瘤标记物的实验研究

龙雯晴　 王伟民 　Rodolfo REY　 喇端端 　季晓琼

　　【摘要】　目的　研究抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone, AMH）在诊断卵巢颗粒细胞瘤（granulosa cell tumor，GCT）中作为特异性肿瘤标记物的实验依据。方法　采用免疫组织化学、原位杂交、Northern 杂交法研究转基因小鼠早、晚期卵巢GCT 中AMH及其受体mRNA的表达，并用放射性碘（¹²⁵I）标记法、Northern 杂交法研究经培养的卵巢GCT细胞中AMH及其受体mRNA的表达。结果　转基因小鼠早期卵巢GCT中， AMH的免疫组织化学检测和AMH受体mRNA的原位杂交检测结果显示，两者的阳性表达率均为100%；而晚期卵巢GCT中，两者的阳性表达均为8例中2例，分别比较，差异均有极显著性（P＜0.01）。 Northern 杂交研究同样显示，早期卵巢GCT和卵巢GCT细胞AMH受体mRNA的阳性表达率均为100%。放射性自显影的研究显示，在卵巢GCT细胞膜处有放射性亮点，¹²⁵I标记的AMH与卵巢GCT细胞结合率达100%。结论　AMH可作为一种特异性的肿瘤标记物；可用于卵巢疑难肿瘤的鉴别诊断以及早期卵巢GCT的诊断；有可能成为卵巢GCT治疗和随访的观察指标。
　　【关键词】睾丸激素类；生长抑制物；肿瘤标记，生物学；卵巢肿瘤；颗粒细胞瘤

Study on the Anti-Mullerian Hormone Served as a Marker for Granulosa Cell Tumor of Ovary

LONG Wenqing， WANG Weimin, Rodolfo REY, et al.
（Department of Obstetrics and Gynecology, RuiJin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China）

　　【Abstract】　Objective　To probe the experimental basis for anti-mullerian hormone（AMH）served as a specific tumor label in diagnosis of granulosa cell tumor（GCT）of ovary. Methods　The expression of AMH and its receptor mRNA in early and late GCT of ovary in transgenic mice was studied by using immunohistochemistry, in stiu hybridization and Northern hybridization．Furthermore，the expression of AMH and its receptor mRNA in cultured GCT cells was also determined by using radioiodine labeling method and Northern hybridization. Results　In the early ovary GCT of transgenic mice, immunohistochemistry showed that AMH was positively stained as brownish yellow granulars，which were located in the cell membrane of the tumor, in situ hybridization showed its receptor mRNA was positive as blue granulars，which were also located in the cell membrane．The positive rate of both AMH and its receptor mRNA was 100％. Results by northern hybridization also showed that the positive rate of AMH and its receptor mRNA in the early ovary GCT and GCT cells was 100%. Radioautography indicated that there was a radioactive bright point, the binding rate of　¹²⁵I labeled AMH with tumor cells reached 100％. Conclusions　AMH can be served as a specific tumor marker in the diagnosis of difficult and complicated tumors of ovary， and in the diagnosis，treatment and follow-up survey of the early GCT.
　　【Key words】Testicular hormones; Grouth inhibitors；Tumor markers, biological；Ovarian neoplasms； Granular cell tumor

　 分泌雌激素是卵巢颗粒细胞瘤（granulosa cell tumor, GCT）重要的临床特点，但因缺乏特异性，不能将其作为临床诊断的依据。对于远期复发和转移的卵巢GCT更难及早发现。已报道的20年生存率提示，近50%的患者可能死于该肿瘤的复发。Rey等^［1］和Long等^［2］发现，血清抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone, AMH）是卵巢GCT最敏感和最具有特异性的标记物。本研究则进一步探讨AMH及其受体mRNA在卵巢GCT中的表达，以期更好地标记卵巢GCT，为临床应用AMH对卵巢GCT进行诊断、治疗及随访提供实验依据。现报道如下。

材料与方法

　　研究于1996年9月至1998年8月在法国生命医学及药物研究所493研究室（INSERM U493）进行。
　　一、 材料来源
　　1. 卵巢GCT动物模型的建立：用聚合酶链反应（PCR）对可发育成卵巢GCT或睾丸支持细胞肿瘤的转基因小鼠进行筛选，建立卵巢GCT模型。具体方法如下：（1）因雌性转基因小鼠缺乏生殖能力，故用其雄性小鼠^［3］（INSERM U493提供）和正常雌性小鼠B6-CBA交配。（2）取其子代鼠龄为30 d的小鼠鼠尾，长约1 cm，并经蛋白酶K消化，用常规酚和氯仿抽提法提取DNA。（3）扩增引物（INSERM U493提供）：AMH S₁₇₁₆为5′ CTT ACC AGC CTT CTC CTG GG 3′ ；AMH A₂₇₆₉为5′ TTC CTT GGG CCT TCG GAG GGA AGT 3′。（4）PCR反应：PCR反应液50.0 μl（其中包括DNA模板2.0 μl，引物各2.0 μl，Taq DNA聚合酶0.4 μl）经80℃预变性10 min，95℃变性、60℃褪火、72℃延伸各1 min，共30个循环，72℃延伸5 min。（5）转基因小鼠的基因鉴定：以上PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并在紫外分析仪下观察，如出现1 063 bp扩增条带的小鼠为转基因小鼠。（6）由此得到雌性转基因小鼠即为卵巢GCT模型，共45只，并随机分为2组：A组23只，4～5个月鼠龄时处死, 以期获得早期卵巢GCT；B组22只，12～23个月鼠龄时处死, 以期获得晚期卵巢GCT。分别取其卵巢标本，石蜡包埋固定或直接置液氮中速冻后贮存于-70℃超低温冰箱内。
　　2.卵巢GCT细胞株的培养：将浓度为1×10⁵/ml的卵巢GCT细胞株^［4］ （INSERM U493提供）置于直径为35 mm的培养皿内，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃二氧化碳培养箱中孵育，使细胞贴壁生长增殖，以备RNA提取。
　　二、 实验方法
　　1. 形态学观察：卵巢GCT小鼠的卵巢标本经石蜡包埋、切片、苏木素和伊红(HE)染色，并于光学显微镜下观察其组织学形态特征。
　　2. AMH免疫组织化学观察：将卵巢GCT标本制成厚5 μm的冰冻切片或石蜡切片（常规脱蜡），1%过氧化氢阻断内源性过氧化酶，正常猪血清（丹麦DAKO公司产品）封闭，1∶400兔抗AMH（INSERM U493提供）作为一抗，滴加后4℃孵育过夜，次日加兔抗IgG抗体作为二抗及生物素链霉亲合素-过氧化酶（均为丹麦DAKO公司产品），二氨基联苯氨显色后封片，显微镜检查。每次均以兔IgG（INSERM U493提供）代替一抗作为阴性对照。结果判断：阴性(-)为细胞未着色，弱阳性(+)为细胞中出现淡黄色颗粒，阳性(++)为细胞中出现棕黄色颗粒。
　　3. AMH受体 mRNA的原位杂交：（1）AMH受体探针（INSERM U493提供）用地高辛（德国Boehinger Mannheim公司产品）标记。（2）卵巢GCT标本制成厚5 μm的冰冻或石蜡切片，4%多聚甲醛固定，蛋白酶K消化后预杂交、杂交，洗涤封闭后用甲苯胺蓝染色法显色。用正义RNA探针杂交作为阴性对照。以细胞膜处出现蓝色颗粒者为阳性。
　　4. AMH受体mRNA 的Northern 杂交：（1）卵巢GCT组织及细胞总RNA采用异硫氰酸胍一步法提取。所有标本均经紫外分光光度计（波长分别为260和280 nm）测定其吸光度（A）值，要求A₂₆₀/A₂₈₀=1.70～2.00，并用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。（2）AMH受体探针质粒用Not I 和Sac II限制性酶切，回收片段为300 bp。α32P-dCTP（德国Boehinger Mannheim公司产品）随机引物法标记探针。（3）总RNA 10 μg经1%甲醛变性电泳后，毛细血管法转移至尼龙膜，经紫外线交联固定，42℃预杂交过夜，杂交，洗膜后置-70℃冰箱中进行放射自显影。
　　5. AMH与卵巢GCT细胞的联接：卵巢 GCT细胞在Labtek培养板（德国Costar公司产品）上培养并固定1 d后，与¹²⁵I标记的AMH（1～2 nmol/L）反应。 置4℃冰箱中，和LM乳剂（德国Boehinger Mannheim公司产品）反应14 d，显影并染色后封片观察。以卵巢GCT细胞膜处有放射性亮点为阳性。
　　三、 统计学分析
　　数据以百分率计，并经χ²检验。

结果

　　一、 形态学观察
　　早期卵巢GCT细胞过度增生并环绕成小圆型囊腔，囊腔内为不规则丝网状伊红色物质，可见正常卵泡组织；晚期卵巢GCT细胞极度增生，排列成巢状，或被结缔组织索分隔成片状，或弥漫排列呈片状，并有出血、坏死。两组转基因小鼠发生卵巢GCT的情况见表1。
　　二、AMH及其受体mRNA的表达
　　AMH免疫组织化学染色结果显示，早期卵巢GCT AMH的阳性表达率与晚期者比较，差异有极显著性（P<0.01）。AMH受体 mRNA的原位杂交结果显示，早期卵巢GCT的阳性表达率与晚期者比较，差异有极显著性（P<0.01）。见表2。Northern杂交的研究结果显示，早期卵巢GCT和卵巢GCT细胞的AMH受体mRNA的阳性表达率均为100%。

　　三、AMH与卵巢GCT细胞间的联接
　　放射性自显影显示卵巢GCT细胞膜处有放射性亮点。经¹²⁵I标记的AMH与卵巢GCT细胞间的结合率为100%。

讨论

　　一、AMH概述
　　AMH基因是一种位于19号染色体短臂上的2.4～2.8 kb的小基因，有5个外显子，C端为活性作用端^［4］。人类AMH受体基因总长7.6 kb，有11个外显子，第1～3个外显子编码细胞外区域，对AMH有高度亲和力^［5］。1996年，Rey等^［1］ 和Long等^［2］研究认为，正常绝经后妇女其血清AMH值极低，无法测出；正常绝经前妇女以及除卵巢GCT外的其他肿瘤患者，其血清AMH值很低（<2.0～5.0 μg/L）；若有颗粒细胞呈肿瘤样活跃增生，患者血清AMH值便可以成倍地增长（6.8～117.9 μg/L），而手术切除后则无法测出。因此认为，血清AMH是卵巢GCT最敏感和最具有特异性的标记物。
　　二、 AMH为卵巢GCT特异性标记物的可能性
　　AMH是雌性动物在出生后由窦前卵泡的颗粒细胞分泌并抑制颗粒细胞增生。Rey等^［1］发现，当卵巢GCT复发时，血清AMH值特异性地升高，早于临床症状出现的时间最多可达11个月。本实验中，AMH及其受体mRNA在早期卵巢GCT组织和细胞中阳性表达率达100%，这为临床将AMH作为卵巢GCT的肿瘤标记物提供了可靠的实验依据。
　　三、 AMH应用于卵巢GCT诊断及治疗的前景
　　低分化卵巢内膜样腺癌向间质分化时，有显著的岛状或长的管状结构，它们或呈实质岛状，或呈小滤泡结构，可误认为是卵巢GCT小岛、小梁和Call-Exner小体。此外，富于细胞的卵泡膜纤维瘤、纤维肉瘤、岛状类癌和小细胞癌等卵巢肿瘤，HE染色后，显微镜下也很难与卵巢GCT鉴别。本实验通过对卵巢GCT转基因小鼠卵巢GCT及卵巢GCT细胞株的研究发现，AMH及其受体mRNA在早期卵巢GCT中能很特异性地在其细胞膜处表达。因而能将这些卵巢肿瘤与卵巢GCT区别开来。作为特异性标记物，AMH用于卵巢疑难肿瘤的鉴别诊断将成为可能。在人体内可运用放射性核素标记肿瘤的抗体对肿瘤进行定位诊断^［6］。另外，还可运用亲肿瘤物质作载体，以有细胞毒作用的物质作弹头对肿瘤进行放射免疫治疗。Juweid等^［7］曾将经¹²⁵I标记的癌胚抗原抗体用于晚期卵巢内膜样癌广泛转移的治疗。本研究表明，经¹²⁵I标记的AMH 与卵巢GCT细胞能很特异性地进行联接，这为运用¹²⁵I-AMH抗体对卵巢GCT进行放射免疫诊断及治疗提供了实验依据，尤其有可能将它用于对远期复发和转移及不能手术切除的卵巢GCT的放射免疫治疗。

(本文编辑：姚红萍)

作者单位：龙雯晴（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科）
喇端端（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科）
季晓琼（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科）
王伟民（上海市闸北区中心医院妇产科）
Rodolfo REY（法国生命医学及药物研究所493研究室）

参考文献

　1，Rey R, Lhomme C, Marcillac I, et al. Anti-Mullerian hormone as a serum marker of granulosa cell tumors of the ovary: comparative study with serum alpha-inhibin and estradiol. Am J Obstet Gynecol, 1996, 174:958-965.
　2，Long WQ, Ranchin V, Pautier P, et al. Detection of minimal levels of serum anti-Mullerian hormone during follow-up of patients with ovarian granulosa cell tumor by means of a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85: 540-544.
　3，Dutertre M, Rey R, Porteu A, et al. A mouse sertoli cell line expressing anti-Mullerian hormone and its type II receptor. Mol Cell Endocrinol, 1997, 136:57-65.
　4，Lee MM， Donahoe PK. Mullerian inhibiting substance: a gonadel hormone with multiple functions. Endocr Rev, 1993, 14: 152-164.
　5，Imbeaud S, Faure E, Lamarre I, et al. Insensitivity to anti-Mullerian hormone due to a mutation in the human anti-Mullerian hormone receptor. Nat Genet, 1995, 11:382-388.
　6，曹世龙，主编. 肿瘤学新理论与新技术. 第1版. 上海：上海科技教育出版社, 1997. 834-836.
　7，Juweid M, Sharkey RM, Alavi A, et al. Regression of advanced refractory ovarian cancer treated with iodine-131-labeled anti-CEA monoclonal antibody. J Nucl Med, 1997, 38:257-260.