潘继存　徐新　马玉燕　江森

　　卵巢癌死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首，恶性肿瘤的生长与转移，往往是患者死亡的直接原因，也是恶性肿瘤研究中最重要的问题。基础研究证明，癌基因的过度表达、抑癌基因的失活及细胞生长因子调节的异常，是患者体内正常组织癌变并导致其生物学行为一系列改变的基本原因。为此，我们对卵巢癌组织p53基因的变化及患者体液中白细胞介素6(IL-6)进行检测，研究两者之间的关系及对卵巢癌生物学行为的影响，并对卵巢癌细胞生长转移机理进行了初步探讨。
　　一、资料与方法
　　1.标本收集：自1995年3月至1996年2月，收集山东医科大学附属医院、山东省立医院和山东省泰安市中心医院未经治疗的卵巢上皮性癌30例，其中浆液性囊腺癌20例，粘液性囊腺癌8例，子宫内膜样癌1例，未分化癌1例。临床分期按1988年FIGO标准，Ⅰ期7例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例。组织学分级按3级标准，高分化7例，中分化13例，低分化10例。另有良性卵巢上皮肿瘤10例。术中取新鲜瘤组织及癌旁正常组织，置-70℃冰箱保存待测；同时每例取外周血、腹水(或腹腔液)，置-20℃冰箱保存。另收集行输卵管吻合术的8例健康妇女的外周血、腹腔液冰冻保存以作对照观察。
　　2.实验方法：(1)聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性分析(SSCP)：组织DNA采用常规酚-氯仿抽体法提取，PCR试剂盒和p53基因第5～7外显子PCR引物，由北京医科大学分子病理学实验室提供。取DNA模板20 μl，加入30 μl反应混合液，置PCR仪中，94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，循环30次，最后1次循环后72℃延伸7分钟。将PCR扩增产物与变性液(含甲酰胺、EDTA、溴酚蓝和二甲苯蓝)混匀后，95℃变性5分钟后骤冷，取样10 μl于聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳中分离，硝酸银染色显示条带，同一凝胶中与对照组DNA比较，单链DNA电泳条带出现位置异常泳动者，即视为有基因突变产生。(2)IL-6测定：采用IL-6依赖株(MH60-BSF2)细胞增殖法，以四甲基偶氮唑蓝比色法^［1］对卵巢癌、良性卵巢肿瘤患者及健康妇女的血清、腹水(或腹腔液)进行检测。
　　二、结果
　　1.p53基因突变及其与卵巢癌临床期别及组织学类型与分级的关系：p53基因的突变率为43.3%(13/30)，基因突变在外显子5～7分别为4、3、6例。Ⅲ～Ⅳ期突变率(62.5%，10/16)明显高于Ⅰ～Ⅱ期(21.4%，3/14)(P<0.05)，但与组织学类型和分级无相关性。所有良性卵巢肿瘤和癌旁正常组织均未发现p53基因突变。
　　2.卵巢癌患者与对照组体液中IL-6水平：卵巢癌患者血清中IL-6水平为106.49±74.19 kU/L，明显高于良性卵巢肿瘤的54.38±38.85 kU/L和健康妇女的54.15±25.54 kU/L (P<0.05)；卵巢癌患者腹水中IL-6水平为207.94±131.97 U/ml，较良性卵巢肿瘤的74.46±21.50 kU/L和71.65±13.67 kU/L升高尤为明显(P<0.01)；而良性卵巢肿瘤与健康妇女比较，差异无显著性(P>0.05)。
　　3.卵巢癌患者体液中IL-6水平与临床期别及组织学类型与分级的关系：Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者血清中IL-6水平为131.50±81.40 kU/L，明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者的63.27±42.24 kU/L(P<0.05)。且Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者腹水中IL-6水平为253.60±141.53 kU/L，明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者129.07±60.27 kU/L(P<0.01)。多见于卵巢浆液性囊腺癌和低分化癌。
　　4.p53基因突变与患者体液中IL-6水平的关系：30例卵巢癌中，p53基因突变患者体液中IL-6水平高于p53基因无突变者。两者比较，差异无显著性(P>0.05)。
　　三、讨论
　　1.p53基因突变对卵巢癌发生及发展的影响：p53是一种抑癌基因，其突变、失活与大多数肿瘤的发生及发展有关。p53基因突变的好发部位在外显子5～8个高度保守结构区。本研究采用非同位素PCR-SSCP方法对卵巢癌原发灶(新鲜癌组织)p53基因第4～7外显子突变进行了检测，结果显示，p53基因突变在外显子5～7分别为4、3、6例，突变率为43.3%。Ⅰ～Ⅱ期p53基因突变率为21.4%，明显低于Ⅲ～Ⅳ期的62.5%(P<0.05)，并多见于低分化的肿瘤。Jacobs等^［2］证实，如果卵巢部位有p53基因突变，同样的突变几乎均见于腹腔内各肿瘤转移灶，说明晚期卵巢癌是单克隆性的。并且腹腔内各肿瘤点是由原发灶转移而来，在原发或转移灶中，同样p53基因变化的出现，提示p53基因突变始于转移过程开始之前，可作为癌瘤侵蚀进展的标志，p53基因突变多见于Ⅲ～Ⅳ期和低分化癌，与p53基因突变多见于单倍体肿瘤的文献报道一致^［3］。肿瘤组织中，DNA单倍体被认为是患者预后差的指标。因此，我们认为，p53基因改变确实与卵巢癌的生物学行为有关，但其具体机理有待进一步研究。
　　2.IL-6对卵巢癌发生及发展的影响：有关的基础研究证实^［4］，正常卵巢上皮可持续分泌IL-6，刺激卵巢上皮增生，参与卵巢排卵后表面破裂口的修复。在卵巢癌细胞培养上清液中，可测出IL-6活性及IL-6受体(IL-6R) mRNA表达，并可刺激细胞增殖。本研究结果显示，卵巢癌患者血清及腹水中IL-6水平明显高于良性卵巢肿瘤患者和健康妇女，其中卵巢癌患者腹水中IL-6水平升高更为明显，比健康妇女高2.9倍(P<0.01)，且随临床期别的增加，IL-6随之升高，而良性卵巢肿瘤患者与健康妇女之间则无差异，表明IL-6在卵巢癌细胞的生长与转移中发挥一定作用。IL-6的过度产生，有利于肿瘤细胞的生长。随癌细胞不断增殖，IL-6在肿瘤部位大量产生并浓集于腹腔内，可促进癌细胞的侵蚀和转移，临床晚期癌患者腹腔内癌细胞广泛种植，而腹腔外缺乏转移灶，也支持这一观点。
　　另外，p53基因的变化与卵巢癌细胞生长因子IL-6之间的关系。本研究进行了探讨，结果表明，p53基因突变患者腹水中IL-6水平高于p53基因无突变者，但两组比较差异无显著性。p53基因突变患者体液中IL-6水平升高，与p53突变增强了转录因子C/EBP β介导的IL-6转录活性有关^［5］。卵巢癌侵蚀机理复杂，其转移过程依赖于各种与转移相关因素之间促进和抑制的平衡，由于各因素之间存在着错综复杂的关系，单一因素的变化往往不会引起其他因素的明显改变。抑癌基因p53的突变，细胞因子IL-6的大量产生和调节异常及两因素之间的相互作用，在卵巢癌细胞的生长与转移中发挥了重要作用。

参考文献

　1　Mosman T. Rapid colormetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55-63.
　2　Jacobs IJ, Kohler MF, Wiseman RW, et al. Clonal origin of epithelial ovarian carcinoma: analysis by loss of heterozygosity, p53 mutation and x-chromosome inactivation. J Natl Cancer Inst, 1992, 84:1793-1798.
　3　McManus DT, Murphy M, Arthur K, et al. p53 mutation, allete loss on chromsome 17p, and DNA content in ovarian carcinoma. J Pathol, 1996, 179:177-182.
　4　Lidor AJ, Xu FJ, Martinez-Maza O, et al. Constitutive production of marcrophage colony-stimulating factor and interleukin-6 by human ovarian surface epithelial cells. Cell Res, 1993, 207:332-339.
　5　Margulies L, Sehgial PB. Modulation of the human interleukin-6 promoter (IL-6) and transcription factor C/EBPβ activity by p53 species. J Biol Chem, 1993, 20:15096-15100.

　　作者单位：271000 山东省泰山医学院附属医院妇产科(潘继存)；泰山医学院(徐新)；山东医科大学附属医院妇产科(马玉燕，江森)

(收稿：1997-10-14　　修回：1998-05-06)